益母草堿基由CaMKⅡ/Cx36信號(hào)對(duì)七氟醚誘導(dǎo)幼鼠突觸可塑性的改善作用

肖志博 金輝 謝海 符少川 葛樹(shù)勝

認(rèn)知功能損傷是幼兒術(shù)后常見(jiàn)并發(fā)癥，如何保護(hù)患者避免損傷一直是研究重點(diǎn)。益母草堿 (Leonurine,SCM-198,Leo) 是益母草中提取分離的生物堿，研究顯示Leo是一種增強(qiáng) BDNF/TrkB/CREB 信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn)神經(jīng)元存活的藥物，對(duì)阿爾茲海默病模型小鼠行為學(xué)和生化指標(biāo)具有正向調(diào)節(jié)作用[1]。此外，Leo可通過(guò) c-Jun N 末端激酶途徑發(fā)揮抗氧化作用，減輕腦出血中的水腫和神經(jīng)炎癥[2]。因此，Leo具有明顯的中樞神經(jīng)保護(hù)作用，然而，Leo對(duì)七氟醚麻醉幼鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用和潛在的分子靶點(diǎn)仍不清楚。哺乳動(dòng)物腦組織中，神經(jīng)元之間的縫隙連接與其旁路蛋白形成了類似化學(xué)突觸的“電突觸”，維持了神經(jīng)元活動(dòng)的閾上和閾下同步，成為突觸回路中重要組成部分。縫隙連接的分子底物是連接蛋白36 (connexin 36,Cx36)，其表達(dá)受鈣調(diào)蛋白激酶 Ⅱ (calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)調(diào)控，具有促進(jìn)突觸間小分子如環(huán)磷酸腺苷、三磷酸肌醇和 Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[3]。研究顯示，Cx36敲除會(huì)導(dǎo)致海馬和皮質(zhì)中神經(jīng)元縫隙連接丟失，影響神經(jīng)元振蕩活動(dòng)[4]。此外，在認(rèn)知功能障礙的老齡大鼠海馬中可見(jiàn)明顯的Cx36表達(dá)減少[5]。因此，本研究擬采用出生后7日齡幼鼠，吸入七氟醚麻醉后檢測(cè)Cx36的表達(dá)。通過(guò)益母草堿給藥，探究其對(duì)七氟醚誘導(dǎo)幼鼠認(rèn)知功能的改善作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的SPF級(jí)SD大鼠母鼠及其所產(chǎn)乳鼠，乳鼠約7 d齡，體重10～15 g，60只，由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供。飼養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃，濕度(55±5)%，晝夜循環(huán)12/12 h，訂制孕鼠飼料，自由飲水，母鼠與其乳鼠同窩喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與方案 乳鼠在7日齡時(shí)以3%七氟醚麻醉，持續(xù)6 h。將麻醉后乳鼠隨機(jī)分為七氟醚組、益母草堿-低劑量組(益母草堿-L,2.5 mg/kg)、益母草堿-中劑量組(益母草堿-M,5 mg/kg)、益母草堿-高劑量組(益母草堿-H,10 mg/kg)，對(duì)照組乳鼠僅吸入載體空氣，持續(xù)3 h，每組12只。乳鼠麻醉后每日腹腔注射對(duì)應(yīng)劑量的益母草堿，連續(xù)給藥28 d，對(duì)照組與七氟醚組分別給予等體積0.9%氯化鈉溶液。幼鼠約35 d時(shí)，開(kāi)展水迷宮測(cè)試，期間持續(xù)給藥。水迷宮完成后取腦組織分別開(kāi)展電生理測(cè)試評(píng)估長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，采用HE染色評(píng)估神經(jīng)元狀態(tài)，通過(guò)高爾基染色檢測(cè)神經(jīng)元樹(shù)突棘狀態(tài)，利用Western blot檢測(cè)CaMKⅡ/Cx36信號(hào)通路蛋白表達(dá)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 益母草堿(美國(guó)MCE公司，規(guī)格：25 mg，純度≥ 99.0%)；七氟醚(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：H20190206)；人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF，南京億迅生物科技有限公司)；高爾基染色試劑盒(美國(guó)Hitobiotec公司)；Anti-Cx36、Anti-p-CaMKⅡ、Anti-CaMKⅡ、β-actin抗體(美國(guó)Abcam公司)；HRP標(biāo)記山羊抗鼠/兔抗體(上海碧云天生物科技公司)；Morris水迷宮設(shè)備與系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物科技有限公司，型號(hào)：SA201)；膜片鉗放大器系統(tǒng)(瑞士Axon公司，型號(hào)：MultiClamp 700B，MultiClamp 1550B)；激光共聚焦顯微鏡(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：CellInsight CX7 LZR)；電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司，型號(hào)：Mini-PROTEAN Tetra)；顯影儀(上海天能科技有限公司，型號(hào)：1600/1600R)。

1.4 水迷宮測(cè)試 水迷宮裝置是一個(gè)直徑1.2 m，深0.5 m的圓形水池，分為4個(gè)象限，第Ⅰ象限設(shè)置一個(gè)半徑6 cm的圓形平臺(tái)。正上方固定一個(gè)攝像機(jī)，記錄幼鼠的游泳線路。訓(xùn)練期間，將幼鼠投入水中，自由游泳90 s，當(dāng)幼鼠登上逃生平臺(tái)，記錄這段時(shí)間為逃避潛伏期；若幼鼠未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)至平臺(tái)。訓(xùn)練4 d，撤去平臺(tái)，將幼鼠投入第Ⅲ象限中，記錄90 s內(nèi)幼鼠游泳軌跡，軟件分析獲得幼鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)、第Ⅰ象限停留時(shí)間。

1.5 電生理測(cè)試 將幼鼠處死，以預(yù)冷氧飽和高糖緩沖液經(jīng)體外循環(huán)灌注，取出腦組織，包埋后制備橫向腦組織切片，厚度約400 μm。將切片轉(zhuǎn)移至32℃的氧飽和ACSF中平衡以維持神經(jīng)元狀態(tài)。定位腦組織海馬 CA1 區(qū)，插入聚四氟乙烯涂層的鎢絲電極(A-M Systems)，刺激 Schaffer collateral-commissural通路引發(fā)場(chǎng)興奮性突觸后電位 (field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)，以充滿 ACSF 的玻璃微電極記錄信號(hào)。在此期間，調(diào)整刺激強(qiáng)度以引發(fā)不同的fEPSP，設(shè)基線為200 μA電流下誘導(dǎo)的最大值的40%。固定電極與刺激強(qiáng)度，穩(wěn)定記錄20 min，更換高頻刺激誘發(fā)長(zhǎng)時(shí)程電位增強(qiáng)(long term potentiation,LTP)，連續(xù)20串刺激，每串包含200個(gè)脈沖，頻率為200 Hz，波寬200 μs，串間隔30 s，記錄60 min。

1.6 高爾基染色 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)開(kāi)展高爾基染色。將幼鼠處死，以預(yù)冷的PBS經(jīng)體外循環(huán)灌注。取腦組織浸泡于試劑盒中的溶液1、2混合液(溶液1、2及以下的溶液3、4、5均來(lái)自于試劑盒)中，4℃避光儲(chǔ)存14 d。取出腦組織浸入5倍體積的溶液3中，4℃避光孵育48 h。取出腦組織放入預(yù)冷的異戊烷中冷凍并切成約10 μm的切片，轉(zhuǎn)移至滴有溶液3的載玻片上貼片。將切片放入溶液4、5混合液中反應(yīng)30 min，以蒸餾水沖洗玻片。再通過(guò)梯度乙醇脫水，以二甲苯Ⅰ與二甲苯Ⅱ透化，使用中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下捕獲突觸圖像，對(duì)樹(shù)突棘密度和長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)。

1.7 Western blot 幼鼠處死后取海馬組織，加入RIPA裂解液研磨成單細(xì)胞懸液，離心后上樣緩沖液。開(kāi)展SDS-PAGE凝膠電泳，電壓條件：60 V，30 min;120 V，60 min。截取目標(biāo)蛋白條帶，通過(guò)濕法轉(zhuǎn)膜將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件：2 Ma,60 min。取出PVDF膜，4%脫脂牛奶，以一抗稀釋液孵育，4℃過(guò)夜，包括Anti-Cx36、Anti-p-CaMKⅡ、Anti-CaMKⅡ(1∶1 000)。次日，取出PVDF膜，滴加HRP標(biāo)記IgG(H+L)二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫避光孵育2 h。將ECL發(fā)光液滴加的PVDF膜上，顯影獲得蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)估幼鼠認(rèn)知功能結(jié)果 訓(xùn)練期間，自第2天開(kāi)始，與對(duì)照組相比，七氟醚組幼鼠水迷宮訓(xùn)練期間逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)；自第3天起，與七氟醚組相比，益母草堿-H組幼鼠逃避潛伏期明顯減少(P<0.05)；與此同時(shí)，與益母草堿-L組相比，益母草堿-H組逃避潛伏期也明顯減少(P<0.05)。測(cè)試期間，與對(duì)照組相比，七氟醚組逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)，第Ⅰ象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與七氟醚組相比，益母草堿-H組逃避潛伏期明顯減少(P<0.05)，第Ⅰ象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 水迷宮訓(xùn)練期間幼鼠逃避潛伏期比較

表2 水迷宮測(cè)試期間幼鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較

2.2 電生理檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)程電位增強(qiáng)結(jié)果 與對(duì)照組相比，七氟醚組幼鼠長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)電位水平明顯降低(P<0.05)，與七氟醚組相比，益母草堿-M/H組長(zhǎng)時(shí)程電位水平明顯增加(P<0.05)，且與益母草堿-L組相比，益母草堿-H組長(zhǎng)時(shí)程電位水平明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 5組幼鼠長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)電位的變化；a表示與對(duì)照組相比P<0.05；b表示與七氟醚組相比P<0.05；c表示與益母草堿-L組相比P<0.05；F=3.76，P=0.005

2.3 高爾基染色評(píng)估神經(jīng)元樹(shù)突棘狀態(tài)結(jié)果 對(duì)照組幼鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)比較規(guī)則、排列整齊、密度大、蘑菇狀樹(shù)突棘數(shù)目較多；與對(duì)照組相比，七氟醚組樹(shù)突棘分支數(shù)量明顯減少、形態(tài)不規(guī)則、排列松散、長(zhǎng)度縮短；在益母草堿治療的3組中，與七氟醚組相比，益母草堿-L組樹(shù)突棘形態(tài)、總量和蘑菇狀樹(shù)突棘變化均不顯著(P>0.05)；而益母草-H組樹(shù)突棘密度與長(zhǎng)度明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 5組幼鼠神經(jīng)元樹(shù)突棘高爾基染色

表3 5組幼鼠神經(jīng)元樹(shù)突棘密度與長(zhǎng)度比較

2.4 Western blotting 檢測(cè)CaMKⅡ與Cx36蛋白表達(dá)結(jié)果 與對(duì)照組相比，七氟醚組幼鼠海馬組織中p-CaMKⅡ與Cx36表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與七氟醚組相比，益母草堿-M/H組p-CaMKⅡ與Cx36表達(dá)明顯增加(P<0.05)；此外，與益母草堿-L組相比，益母草堿-H組p-CaMKⅡ與Cx36表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 5組幼鼠CaMKⅡ與Cx36蛋白電泳圖

表4 5組幼鼠CaMKⅡ與Cx36蛋白表達(dá)量化統(tǒng)計(jì)比較

3 討論

隨著社會(huì)進(jìn)步，越來(lái)越多患有先天性疾病的嬰幼兒可通過(guò)手術(shù)矯正。七氟醚相比于其他麻醉藥物，具有效能高、易控制、恢復(fù)快、刺激小的優(yōu)勢(shì)，在嬰幼兒手術(shù)中廣泛應(yīng)用[6]。然而，七氟醚麻醉期間腦組織中葡萄糖代謝會(huì)不同程度降低[7]。相比腦組織成熟發(fā)育的成年人，嬰幼兒患者更易受到葡萄糖代謝紊亂的影響，在全麻手術(shù)后近期或遠(yuǎn)期出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知功能損傷。

認(rèn)知功能障礙是幼兒手術(shù)后常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為記憶力、抽象思維及定向力障礙。文獻(xiàn)中顯示，七氟醚麻醉會(huì)對(duì)剛出生幼鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟和髓鞘的形成產(chǎn)生不可逆的影響，成年后表現(xiàn)出減少的探索行為與增加的焦慮樣癥狀[8]。為了模擬臨床，本研究通過(guò)3%七氟醚麻醉7 d齡幼鼠6 h。結(jié)果顯示，Morris水迷宮訓(xùn)練與測(cè)試期間七氟醚組幼鼠逃避潛伏期明顯增加，穿越平臺(tái)次數(shù)與第Ⅰ象限停留時(shí)間減少。Morris水迷宮是一種評(píng)估嚙齒類動(dòng)物行為記憶、空間探索功能的研究方法。訓(xùn)練期間逃避潛伏期的減少與動(dòng)物學(xué)習(xí)能力相關(guān)，而測(cè)試期間空間探索中穿越平臺(tái)次數(shù)及第Ⅰ象限停留時(shí)間反映了動(dòng)物記憶能力[9]。因此，以上結(jié)果提示本研究POCD模型構(gòu)建成功。此外，益母草堿-M/H組幼鼠逃避潛伏期明顯低于七氟醚組，且穿越平臺(tái)次數(shù)與第Ⅰ象限停留時(shí)間明顯增加，但益母草堿-L組各項(xiàng)指標(biāo)沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明益母草堿治療可以改善七氟醚麻醉幼鼠的認(rèn)知功能，且存在劑量依賴性。

突觸是指神經(jīng)元之間或與其他細(xì)胞之間相互連接的接觸點(diǎn)。樹(shù)突棘是建立突觸聯(lián)系的基本結(jié)構(gòu)，Cx36是突觸縫隙連接的主要底物，兩者共同構(gòu)成突觸結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)興奮性信號(hào)傳導(dǎo)[10]。POCD模型大鼠腦中常見(jiàn)明顯的樹(shù)突棘萎縮，蘑菇狀結(jié)構(gòu)消失，樹(shù)突棘密度降低的病理特征[11]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)中POCD模型動(dòng)物病理癥狀一致，5組七氟醚誘導(dǎo)幼鼠海馬組織中樹(shù)突棘萎縮，密度降低。此外，七氟醚誘導(dǎo)幼鼠海馬組織中Cx36表達(dá)與p-CaMKⅡ表達(dá)明顯減少。Cx36作為突觸間縫隙連接底物，影響著突觸間神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞效率。在MPTP點(diǎn)燃的癲癇小鼠模型中，通常可見(jiàn)明顯的Cx36表達(dá)增加，造成突觸傳遞過(guò)度興奮，產(chǎn)生連續(xù)的去極化與超極化，導(dǎo)致異常放電[12]。CaMK Ⅱ?qū)儆诮z氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶家族，受Ca2+調(diào)控，通過(guò)磷酸化與Cx36結(jié)合，在神經(jīng)元與其他蛋白之間形成“電突觸”，促進(jìn)興奮性信號(hào)的傳導(dǎo)[13]。已有研究表明CaMK Ⅱ在海馬區(qū)密集分布，抑制CaMK Ⅱ信號(hào)會(huì)影響小鼠海馬區(qū)突觸可塑性，繼而影響小鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力[14]。

突觸可塑性是基于樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)與縫隙連接蛋白改變產(chǎn)生的傳遞效能變化[15]。LTP是突觸可塑性的量化表現(xiàn)，是在短暫快速重復(fù)性刺激下，突觸間電位持續(xù)性增強(qiáng)的現(xiàn)象，反映了動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶功能[16]。由于大腦邊緣系統(tǒng)海馬組織對(duì)葡萄糖代謝障礙最為敏感，是POCD患者受損最早且最易受累的腦區(qū)，其LTP損害與學(xué)習(xí)記憶的缺損高度相關(guān)[17]。因此海馬區(qū)LTP誘導(dǎo)操作容易，已成為L(zhǎng)TP研究的典型區(qū)域。本研究顯示，七氟醚刺激下，LTP水平降低，提示七氟醚造成海馬突觸可塑性損傷。此外，與七氟醚組相比，益母草堿-H組樹(shù)突棘狀態(tài)明顯改善，LTP水平明顯增加，且海馬組織中p-CaMKⅡ與Cx36表達(dá)明顯增加。因此，益母草堿對(duì)樹(shù)突棘和縫隙連接構(gòu)成的突觸可塑性具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，益母草堿可以逆轉(zhuǎn)七氟醚造成的樹(shù)突棘密度與長(zhǎng)度的減少，增加LTP水平，提高幼鼠海馬組織神經(jīng)元突觸可塑性，改善幼鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能，且該保護(hù)作用可能涉及CaMKⅡ/Cx36信號(hào)的激活。然而，本研究也存在一定的局限性，本研究?jī)H檢測(cè)了p-CaMKⅡ與Cx36表達(dá)，卻沒(méi)有通過(guò)抑制劑或激動(dòng)劑探究CaMKⅡ/Cx36信號(hào)對(duì)海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響。此外，幼鼠全麻后出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷往往與神經(jīng)元新生抑制相關(guān)[18]，進(jìn)一步研究中應(yīng)繼續(xù)探討CaMKⅡ/Cx36信號(hào)對(duì)神經(jīng)元新生的影響。