沉默miR-210對非小細(xì)胞肺癌大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制研究

賈依登·肯加別克 羅琴 曹國磊 葉斯波力·塔斯恒

非小細(xì)胞肺癌是指除小細(xì)胞肺癌以外的所有肺上皮癌的疾病。現(xiàn)在醫(yī)學(xué)將肺癌分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩種，其中比較多見的是鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌以及腺癌等等[1,2]。其發(fā)病的因素主要是受到吸煙行為的影響，由于其對放療、化療等治療敏感度較低，所以治療效果不甚理想，目前對于該病的治療一般采用手術(shù)方式切除[3,4]。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病速度、癌癥擴(kuò)散速度與小細(xì)胞癌相比較慢，但是一般發(fā)現(xiàn)即是晚期，非常難以控制和治療[5]。近年來非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率越來越高，對于該病的治療引起了眾多學(xué)者的研究[6]。微小RNA(miRNA)在該病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，miR-210是目前已知的可能與miR-210相關(guān)mRNA，目前關(guān)于miR-210與非小細(xì)胞肺癌病情的相關(guān)研究鮮少[7]。基于上述背景，在本文中分析上調(diào)微小RNA-210(miR-210)對非小細(xì)胞肺癌模型大鼠的影響，以明確miR-210是否參與此病的發(fā)生進(jìn)展，為臨床上此病的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究選取40只SD健康雄性大鼠[河北中旭檢驗(yàn)檢測技術(shù)有限公司，動物使用許可證號：SYXK(冀)2020-009]，鼠齡7～10周，平均(8.6±1.2)周；體重216～240 g，平均(227.9±9.6)g。所有大鼠于(23.8±3.1)℃、濕度50%左右、循環(huán)12 h燈光(光照/黑暗)環(huán)境中喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組：隨機(jī)挑選10只大鼠為正常組，不做任何處理。其余30只分別建立鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌大鼠肺癌模型，用Hank’s液將鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌細(xì)胞調(diào)至濃度為1×106/ml的細(xì)胞混懸液，并在每只大鼠背經(jīng)脈注射0.2 ml，以制備3種非小細(xì)胞肺癌模型各15只，連續(xù)飼養(yǎng)7 d。模型動物分為模型組、上調(diào)組和沉默組，每組篩選9只。模型組予背靜脈注射0.9%氯化鈉1 ml；上調(diào)組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agoCARD9，下調(diào)組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg antagoCARD9，均連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 HE染色：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集靜脈血，離心，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩Ａ⒓刺幩来笫螅》谓M織，4%多聚甲醛中固定，置于-80℃冰箱中保存待用。肺組織制備常規(guī)石蠟切片后每組取部分切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化至返藍(lán)，乙醇伊紅復(fù)染后脫水，透明，封片固定，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 血清VEGF及肺轉(zhuǎn)移灶最長徑測定:采用酶聯(lián)免疫吸附法測定VEGF水平，試劑盒均購自山東一達(dá)生物科技有限公司。嚴(yán)格按照ELISA試劑說明書步驟操作，將標(biāo)本血清室溫放置30 s，備置標(biāo)準(zhǔn)血清及溶液，配置300 μl洗板液洗板30 s，倒出，微孔拍干，將50 μl檢測緩沖液、50 μl標(biāo)準(zhǔn)液及樣本和檢測抗體放置微孔里，封板，1 000 r/min震蕩，(37℃)孵育2 h，洗板，酶標(biāo)記物100 μl導(dǎo)入檢測孔，封板，1 000 r/min轉(zhuǎn)速震蕩，放置恒溫室溫內(nèi)45 min，洗板，100 μl底物液導(dǎo)入微孔，遮光孵育30 min，加入100 μl終止液，搖晃均勻，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值。

1.3.3 miR-210表達(dá)檢測：采用實(shí)時熒光定量PCR法測定。細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，GAPDH為內(nèi)參，提取細(xì)胞總RNArimer5.0軟件設(shè)計引物反應(yīng)條件：96℃ 5 min、96℃ 30 s、55℃退火 30 s,72℃延伸，35個循環(huán)，2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。miR-210上游引物：5’-ATGGTTCGTGGGAGCCCCTGCCCACCGCA-3’；下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。以U6為內(nèi)參，U6上游引物:5’-CTCGCATCGCGTAAGGCACA-3’；下游引物：5’-AACGCTACTCGAATTAGCGT-3’。

1.3.4 PI3K/Akt/HIF-1a通路蛋白相對表達(dá)量對比：采用Western Blot法測定，對所有收集并培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行離心、蛋白提取，然后使用BCA做蛋白定量測定，將50 μg蛋白加入至2×SDS凝膠緩沖液中，轉(zhuǎn)膜、取膜、固定、做電泳1.5 h封閉處理，以1∶1 000的比例將TBST稀釋的PI3K/Akt/HIF-1a一抗，在4℃的環(huán)境中孵育過夜，TBST反復(fù)3次洗膜，將1∶10 000 TBST稀釋的二抗加入，搖動孵育1 h，TBST反復(fù)3次洗膜，DAB做顯色處理，對此并分析蛋白表達(dá)水平，以GAPDH蛋白為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠非小細(xì)胞肺癌組織病理學(xué)觀察 正常組大鼠肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，無充血、水腫等病理變化，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組、上調(diào)組大鼠肺組織細(xì)胞排列無規(guī)則，且大量壞死，充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤情況較明顯；下調(diào)組大鼠肺組織細(xì)胞壞死、充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤等病理變化明顯減輕。見圖1。

正常組模型組上調(diào)組沉默組

2.2 轉(zhuǎn)染效率鑒定 模型組、上調(diào)組、沉默組miR-210表達(dá)量與正常組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組、沉默組大鼠miR-210表達(dá)量與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；沉默組miR-210表達(dá)量與上調(diào)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明miR-10a轉(zhuǎn)染成功。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染效率鑒定

2.3 4組大鼠血清VEGF及肺轉(zhuǎn)移灶最長徑變化 與正常組相比，模型組、上調(diào)組、沉默組大鼠VEGF水平和肺轉(zhuǎn)移灶最長徑均升高(P<0.05)；上調(diào)組、沉默組大鼠VEGF、肺轉(zhuǎn)移灶最長徑水平與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與上調(diào)組相比，沉默組大鼠VEGF、肺轉(zhuǎn)移灶最長徑水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清VEGF及肺轉(zhuǎn)移灶最長徑變化

2.4 4組大鼠腫瘤標(biāo)志物水平變化 與正常組相比，模型組、上調(diào)組、沉默組大鼠SCC-Ag、CEA、CYFRA21-1水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組、沉默組大鼠SCC-Ag、CEA、CYFRA21-1水平與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與上調(diào)組相比，沉默組大鼠SCC-Ag、CEA、CYFRA21-1水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠腫瘤標(biāo)志物水平變化

表4 4組大鼠免疫功能指標(biāo)比較

2.6 4組PI3K/Akt/HIF-1a通路蛋白表達(dá)對比 模型組、上調(diào)組、下調(diào)組大鼠PI3K/Akt/HIF-1a表達(dá)與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，上調(diào)組、下調(diào)組大鼠PI3K/Akt/HIF-1a表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與上調(diào)組相比，下調(diào)組PI3K/Akt/HIF-1a表達(dá)降低(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 4PI3K/Akt/HIF-1a通路蛋白表達(dá)比較

圖2 PI3K/Akt/HIF-1a通路蛋白表達(dá)WB圖；A 正常組；B 模型組；C 上調(diào)組；D 沉默組

3 討論

肺癌在我國男、女性中的發(fā)病率較高，死亡率也是第一位[8]。非小細(xì)胞肺癌占肺癌疾病的比例較大，而且在68%的肺癌患者確診的時候已經(jīng)是晚期，五年生存率<5%[8]。研究顯示，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖是治療前列腺癌研究熱點(diǎn)[9]。

研究結(jié)果說明，基于PI3K/Akt/HIF-1a信號通路沉默miR-210表達(dá)干預(yù)非小細(xì)胞肺癌大鼠，顯示大鼠PI3K/Akt/HIF-1a蛋白表達(dá)降低。PI3K是一種位于胞質(zhì)的脂質(zhì)激酶，在生物學(xué)組織、細(xì)胞、癌衰老等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用，是重要的信號傳遞信使能夠參與Akt依賴性信號通路的活化；Akt是一種絲氨酸激酶，是PI3K的中心下游效應(yīng)因子，PIP3能逐漸磷酸化AKT蛋白參與調(diào)節(jié)VEGF等活性因子，進(jìn)而參與細(xì)胞生長、發(fā)育和血管調(diào)節(jié)的作用[17,18]。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是促血管活性因子，與肺癌的發(fā)展侵襲密切相關(guān)[19]。研究表明，腫瘤細(xì)胞的生長與新生血管的形成之間存在一定的關(guān)系[20]。HIF-1a在缺血性疾病、腫瘤血管生成、胚胎血管化的病理生理過程中期重要作用[21]。本研究中顯示，通過沉默miR-210進(jìn)而干預(yù)對非小細(xì)胞肺癌大鼠進(jìn)行治療，VEGF、肺轉(zhuǎn)移灶最長徑水平降低，此結(jié)果提示，沉默miR-210可以抑制非小細(xì)胞癌細(xì)胞，主要是通過激活PI3K/Akt/HIF-1a信號通路，隨著腫瘤發(fā)生而隨之在血液細(xì)胞中出現(xiàn)的一些指標(biāo)被稱為腫瘤標(biāo)志物，SCC-Ag、CEA、CYFRA21-1是診斷、反映肺癌病情嚴(yán)重程度、預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。在本研究中顯示，經(jīng)沉默miR-210表達(dá)使非小細(xì)胞肺癌大鼠SCC-Ag、CEA、CYFRA21-1水平降低，提示沉默miR-210可能激活PI3K/Akt/HIF-1a信號通路可阻止疾病進(jìn)展，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)，沉默非小細(xì)胞肺癌大鼠miR-210表達(dá)，能夠改善大鼠免疫功能，抑制腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)，可通過升高血清中VEGF水平，促進(jìn)血管新生，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/HIF-1a通路相關(guān)。