miR-27b-3p調控OPA1表達對心力衰竭模型心肌細胞線粒體融合的影響

郝春媛 李同華 任洋 張譽洋

心力衰竭，是不同類型心血管疾病的終末階段，其發病率和死亡率高，且有逐年增加的趨勢，對人類健康威脅極大[1]。研究表明線粒體結構和功能的異常與心力衰竭的發展有關，而線粒體融合與分裂的動態平衡是線粒體發揮正常功能的基礎[2]。心力衰竭的主要病理過程是心肌重構，而線粒體分裂時氧化能力及三磷酸腺苷(ATP)的降低是導致心肌重構發生的主要原因[3]。文獻顯示微小RNA(miRNA)不僅能夠參與調控心肌細胞的生物學行為，還能影響心血管疾病的進程[4]。miR-27b-3p是miR-27家族的一員，其在癌細胞中研究較多，只有袁淑菁等[5]發現miR-27b-3p過表達可促進心肌成纖維細胞纖維化。生物信息學預測發現視神經萎縮蛋白1(optic atrophy protein-1，OPA1)與miR-27b-3p可能存在靶向關系。OPA1是線粒體融合蛋白的一種，研究表明OPA1在心力衰竭模型心肌細胞中下調表達[6]。因此，本研究通過建立心力衰竭模型，觀察miR-27b-3p的表達情況，并探討其對心肌細胞線粒體融合的影響及可能的作用機制，以期為心力衰竭的臨床治療提供新的靶點和參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 miR-27b-3p antagomir及陰性對照antagomir NC、miR-27b-3p inhibitor及陰性對照inhibitor NC、miR-27b-3p mimics及陰性對照mimics NC、OPA1 siRNA及其對照siRNA NC由上海生工生物公司提供；戊巴比妥鈉購自海江萊生物科技有限公司；臺氏液、無鈣臺氏液購自上海撫生實業有限公司；DMEM培養基、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自北京索萊寶生物公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自上海篤瑪生物科技有限公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自上海翌圣生物公司；ATP、ROS、JC-1試劑盒購自上海懋康生物科技有限公司；OPA1、線粒體融合蛋白(mitofusion，MFN)1、MFN2、電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1，VDAC-1)、細胞色素C氧化酶Ⅳ亞型(Cytochrome C oxidase Ⅳ subtype，COXⅣ)、線粒體轉錄因子A(Mitochondrial transcription factor A，Tfam)、過氧化物酶體增殖物激活受體Y輔激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)、自噬標志蛋白Beclin-1、B淋巴細胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(B lymphocytoma-2 gene/adenovirus E1B interaction protein 3，Bnip3)一抗及對應二抗購自美國ABCam公司。透射電鏡購自北京歐波同光學技術有限公司；超薄切片機購自沈陽恒松科技有限公司；二氧化碳培養箱購自山東博科科學儀器有限公司；qRT-PCR儀購自美國ABI公司；小型動物呼吸機購自上海玉研科學儀器有限公司；凝膠成像儀購自北京鴻濤基業科技發展有限責任公司；熒光分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實驗動物 清潔級健康SD雄性大鼠60只，體重為(200.14±10.37)g，由康泰醫學檢驗服務河北有限公司提供，實驗動物許可證號為SYXK(冀)2021-006。大鼠均飼養于我院清潔級動物實驗中心。本研究通過醫院動物倫理委員會許可。

1.3 動物分組、造模與干預方法 大鼠適應性喂養3 d 后，隨機分成Sham組、model組、antagomir NC組和miR-27b-3p antagomir組，每組15只。Sham組除外，其他3組大鼠均按照Lu等[7]的研究方法制備心力衰竭大鼠模型：將麻醉后的大鼠與心電圖連接進行肢體導聯，然后打開左側胸腔，于左心耳根部結扎左冠狀動脈前降支，心電監測顯示ST段弓背型抬高，說明模型制備成功。手術后為預防感染，所有大鼠每天肌內注射15×104U/kg青霉素，連續3 d。Sham組大鼠僅開胸但不結扎，其他操作與上述方法一致。造模完成后，antagomir NC組和miR-27b-3p antagomir組大鼠于尾靜脈分別注射antagomir NC和miR-27b-3p antagomir，而Sham組和model組大鼠注射等量的質量體積分數為9%的氯化鈉溶液，2次/周，連續4周。

1.4 透射電鏡觀察心肌組織線粒體結構變化 4周后，4組大鼠實施安樂死，把心臟取出，剪取心尖位置的心肌組織，快速進行固定，備成70 nm左右的石蠟切片，分別用2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行染色，室溫下晾干，最后在透射電鏡下觀察各組大鼠心肌組織線粒體結構并拍照保存。

1.5 細胞實驗

1.5.1 大鼠心肌細胞的分離與培養：將大鼠心臟取出，去除心包膜的心臟主動脈與離體心臟灌流裝置進行插管連接，依次進行臺氏液、無鈣臺氏液灌流，待心臟跳動停止后使用膠原酶Ⅱ和含胎牛血清的無鈣臺氏液對膠原組織進行消化，等到心臟顏色變淡時，取其左心室組織并放置在KB液中，通過移液槍吸打將單個心肌細胞分離出來。在37℃下，將心肌細胞置于DMEM培養基上，在5%二氧化碳培養箱中培養。

1.5.2 心力衰竭細胞模型構建與分組：在心肌細胞中加入100 μl體積分數為0.8%的戊巴比妥鈉[8](用不含胎牛血清的DMEM培養基溶解)，培養10 min，顯微鏡下觀察，細胞停止搏動說明心力衰竭細胞模型制備成功。將模型構建成功的心肌細胞隨機分成model組(不轉染)、inhibitor NC組(轉染inhibitor NC)、miR-27b-3p inhibitor組(轉染miR-27b-3p inhibitor組)、miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組(共轉染miR-27b-3p inhibitor和siRNA NC)和miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組(共轉染miR-27b-3p inhibitor和OPA1 siRNA)，另取正常培養的細胞作為Control組。

1.5.3 qRT-PCR檢測miR-27b-3p和OPA1 mRNA水平：分別提取1.3中大鼠心肌組織與1.5.2中大鼠心肌細胞的總RNA，然后反轉錄成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒和儀器的使用說明進行PCR擴增。miR-27b-3p正向引物5’-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3’，反向引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6引物序列為：正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；OPA1正向引物5’-TCACTGCGGGTACACCTGG-3’，反向引物5’-CTGACACCTTCCTATAGTGCTTGT-3’；GAPDH引物序列為：正向引物5’-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3’，反向引物5’-CGCCAGTAGACTCCACGACAT-3’。根據2-ΔΔCt法計算miR-27b-3p和OPA1 mRNA的相對表達量，U6或GAPDH為內參基因。

1.5.4 雙熒光素酶實驗檢測miR-27b-3p和OPA1的靶向關系：Targetscan 7.2在線網站預測發現OPA1是miR-27b-3p的潛在靶基因。構建野生型(WT-OPA1)和突變型(MUT-OPA1)載體，利用Lipofectamine 2000轉染試劑將其分別與mimics-NC或miR-27b-3p mimics共轉染至心肌細胞，孵育48 h。然后使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測其酶活。

1.5.5 熒光素酶發光法檢測線粒體ATP合成活力：差速離心法分離4組心肌細胞線粒體，制備成懸液，根據試劑盒的說明書方法處理，并使用熒光分光光度計檢測其熒光強度，并計算ATP合成活力。

1.5.6 DCFH-DA熒光染料檢測線粒體ROS水平：按照ROS試劑盒方法處理線粒體懸液，加入DCFH-DA試劑，分別在488 nm和525 nm波長處檢測其熒光強度，以其熒光強度的比值代表ROS水平。

1.5.7 JC-1熒光探針法檢測線粒體膜電位：將JC-1染色液與線粒體懸液均勻混合，10 min后分別檢測590 nm及527 nm處的熒光強度，并計算膜電位變化(ΔΨm)值，以兩處波長處的熒光強度比值表示。

1.5.8 Western blot檢測線粒體動力蛋白及心肌相關蛋白表達：各組心肌細胞裂解后，提取其中總蛋白，定量后經凝膠電泳將蛋白分離，然后進行轉膜和封閉，分別加入稀釋后的OPA1、MFN1、MFN2、VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α、Beclin-1、Bnip3一抗，次日再加入稀釋后的二抗，靜置1 h，添加化學發光試劑進行顯影，最后使用Image J軟件分析蛋白表達情況。

2 結果

2.1 miR-27b-3p antagomir對大鼠線粒體結構的影響 與Sham組相比，model組大鼠線粒體呈不規則排列，且有明顯的腫脹，大多數線粒體嵴出現模糊、斷裂或者缺失的現象，antagomir NC組大鼠線粒體的形態與model組大鼠類似；與model組和antagomir NC組相比，miR-27b-3p antagomir組大鼠線粒體明顯增多，線粒體膜和嵴的結構均恢復完整。見圖1。

Sham組model組antagomir NC組miR-27b-3p antagomir組

2.2 miR-27b-3p、OPA1 mRNA在4組大鼠心肌組織中的表達水平 與Sham組比較，model組大鼠心肌組織中miR-27b-3p表達明顯增加，OPA1 mRNA表達明顯減少(P<0.05)；與model組和antagomir NC組比較，miR-27b-3p antagomir組大鼠心肌組織中miR-27b-3p表達明顯減少，OPA1 mRNA表達明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 miR-27b-3p、OPA1 mRNA在4組大鼠心肌組織中的表達水平

2.3 miR-27b-3p、OPA1 mRNA在4組大鼠心肌細胞中的表達水平 model組大鼠心肌細胞中miR-27b-3p表達低于Control組高，OPA1 mRNA表達比Control組低(P<0.05)；miR-27b-3p inhibitor組大鼠心肌細胞中miR-27b-3p表達高于model組和inhibitor NC組明顯變低，OPA1 mRNA表達比model組和inhibitor NC組(P<0.05)。見表2。

表2 miR-27b-3p、OPA1 mRNA在4組大鼠心肌細胞中的表達水平

2.4 miR-27b-3p靶向調節OPA1蛋白表達 Targetscan 7.2在線網站預測結果顯示，miR-27b-3p和OPA1存在互補的結合位點，與mimics NC+WT-OPA1組相比，miR-27b-3p mimics+WT-OPA1組相對熒光素酶活性明顯變低(P<0.05)；與mimics NC+MUT-OPA1組相比，miR-27b-3p mimics+MUT-OPA1組相對熒光素酶活性變化不大(P>0.05)。與mimics NC組比較，miR-27b-3p mimics組OPA1蛋白顯著上調(P<0.05)；與inhibitor NC組比較，miR-27b-3p inhibitor組OPA1蛋白顯著下調(P<0.05)。見圖2、3，表3、4。

圖2 miR-27b-3p和OPA1的作用位點

圖3 4組大鼠心肌細胞中OPA1蛋白表達比較；A mimics NC組；B miR-27b-3p mimics組；C inhibitor NC組；D miR-27b-3p inhibitor組

表3 雙熒光素酶實驗

表4 miR-27b-3p靶向調節OPA1蛋白表達

2.5 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細胞中ATP、線粒體ROS及ΔΨm的影響 與Control組相比，model組線粒體ROS水平顯著上升，ATP和ΔΨm顯著下降(P<0.05)；與model組和inhibitor NC組比較，miR-27b-3p inhibitor組線粒體ROS水平明顯下降，ATP和ΔΨm明顯上升(P<0.05)；與miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組和miR-27b-3p inhibitor組相比，miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組線粒體ROS水平明顯增加(P<0.05)，ATP和ΔΨm明顯減小(P<0.05)。見表5。

表5 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細胞中ATP、線粒體ROS及ΔΨm的影響

2.6 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細胞中線粒體動力蛋白表達的影響 model組OPA1、MFN1、MFN2蛋白水平均顯著低于Control組(P<0.05)；miR-27b-3p inhibitor組OPA1、MFN1、MFN2蛋白水平顯著高于model組和inhibitor NC組(P<0.05)；miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組OPA1、MFN1、MFN2蛋白水平明顯比miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組低(P<0.05)，而miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組和miR-27b-3p inhibitor組間蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4，表6。

圖4 6組心肌細胞中線粒體動力蛋白表達比較；A Control組;B model組;C inhibitor NC組;D miR-27b-3p inhibitor組;E miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組；F miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組

2.7 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細胞中心肌相關蛋白表達的影響 與Control組相比，model組VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白表達明顯下調，Beclin-1、Bnip3蛋白表達明顯上調(P<0.05)；與model組和inhibitor NC組比較，miR-27b-3p

表6 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細胞中線粒體動力蛋白表達的影響

inhibitor組VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白表達明顯上調，Beclin-1、Bnip3蛋白表達明顯下調(P<0.05)；與miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組和miR-27b-3p inhibitor組相比，miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白表達顯著下調，Beclin-1、Bnip3蛋白表達顯著上調(P<0.05)。見圖5，表7。

圖5 6組心肌細胞中心肌相關蛋白表達比較;A Control組;B model組;C inhibitor NC組;D miR-27b-3p inhibitor組;E miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC組；F miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA組

表7 miR-27b-3p inhibitor及OPA1 siRNA對6組心肌細胞中心肌相關蛋白表達的影響

3 討論

心力衰竭是心血管疾病發展至嚴重階段的一種臨床綜合征，主要由呼吸道感染、心律失常等引起，臨床上的癥狀為呼吸困難、乏力、咳嗽等。目前臨床上常通過手術或者藥物治療緩解心力衰竭患者的病癥，但無法將其治愈。因此，尋找合適的靶點、降低心力衰竭患者的病死率是臨床上治療心力衰竭的關鍵。

據報道，miR-27b-3p可作為生物標志物，在腎纖維化[9]、心肌梗死后血管再生[10]、心房纖維化[11]等方面起調控作用。相關研究顯示，線粒體結構改變和功能障礙不僅對心臟功能有損害作用，還能加速心力衰竭發展[12]。線粒體融合能使受損的線粒體得到修復，從而恢復心臟功能，減緩心力衰竭過程。本研究結果顯示，心力衰竭模型大鼠心肌組織中miR-27b-3p顯著上調，線粒體結構損傷嚴重；通過miR-27b-3p antagomir下調miR-27b-3p表達后，線粒體形態得到恢復，數量也明顯增加，提示miR-27b-3p下調表達可促進心肌細胞線粒體融合，從而保護心臟功能。

線粒體是向心肌細胞提供能量和產生ROS的重要場所，心力衰竭時線粒體結構被破壞，功能也受到阻礙，導致ROS過度聚集，ATP大量流失，進而刺激心肌細胞凋亡。研究發現心肌細胞線粒體跨膜電位的降低能夠使心臟功能受損，從而促進心力衰竭[13]。本研究通過構建心力衰竭細胞模型發現，model組miR-27b-3p表達明顯升高，該結果與miR-27b在缺氧復氧心肌細胞中的結果[14]類似；miR-27b-3p inhibitor處理能夠顯著降低model組心肌細胞線粒體ROS水平，升高ATP和ΔΨm(P<0.05)，揭示抑制miR-27b-3p表達可通過恢復線粒體功能保護心肌細胞免受損傷。VDAC-1定位于線粒體外膜，參與調節細胞代謝、線粒體凋亡等過程。研究發現VDAC-1在急性心肌梗死大鼠模型中明顯降低[15]。牟連偉等[16]發現COXIV上調表達有助于改善阿爾茲海默病模型小鼠中樞神經元線粒體通透性轉換孔功能。PGC-1α參與調節線粒體生物合成，能夠激活下游靶基因表達。Bnip3、Beclin-1是調控線粒體自噬的關鍵蛋白，二者表達升高，自噬水平增強[17]。本研究結果顯示，model組OPA1、MFN1、MFN2、VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白顯著降低，Beclin-1、Bnip3蛋白表達顯著升高(P<0.05)；miR-27b-3p inhibitor干預后，上述蛋白水平均得到逆轉，說明miR-27b-3p沉默能夠通過調節相關蛋白表達保護線粒體功能，抑制自噬，進而緩解心力衰竭。

Targetscan 7.2網站預測結果顯示OPA1是miR-27b-3p的靶基因。有研究發現OPA1表達提高有助于改善線粒體功能，對壓力過載誘導的心力衰竭有保護作用[18]。本研究結果顯示，心力衰竭模型心肌細胞中OPA1均顯著下調表達，這可能使導致線粒體斷裂的原因之一，提示OPA1對線粒體融合有非常重要的作用。雙熒光素酶實驗結果顯示，共轉染miR-27b-3p mimics和WT-OPA1至心肌細胞時相對熒光素酶活性顯著降低；此外，上調或下調miR-27b-3p時，OPA1蛋白表達明顯降低或升高(P<0.05)，提示miR-27b-3p直接負向調控OPA1蛋白表達。在抑制miR-27b-3p表達的基礎上沉默OPA1表達，戊巴比妥鈉誘導的心肌細胞OPA1、MFN1、MFN2、VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α下調，Beclin-1、Bnip3上調，線粒體ROS升高，ATP和ΔΨm降低(P<0.05)，上述各項指標差異均有統計學意義，提示抑制miR-27b-3p對心力衰竭模型心肌細胞線粒體融合的促進作用與靶向負調控OPA1蛋白表達有關。

綜上所述，miR-27b-3p在心力衰竭模型心肌組織中高表達，抑制miR-27b-3p促進心肌細胞線粒體融合，其機制與負向調節OPA1蛋白水平有關，為心力衰竭的臨床治療提供參考依據。