固相萃取-液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒乳粉中乙基麥芽酚

楊東東，李實飛，林正鋒，謝文強，楊雪蓮，王朝政

（1.海口海關技術中心，?？?570311；2.北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；3.海南大學 食品學院，?？?570228）

0 引言

乙基麥芽酚是一種增香劑，能夠顯著改善食品風味，廣泛應用于食品行業[1-2]，但大量攝入會危害人體健康[3]，我國標準規定嬰幼兒配方食品不得添加食用香料[4]。目前乙基麥芽酚的檢測方法主要有氣相色譜法[5-6]、氣相色譜串聯質譜法[7-8]、液相色譜法[9-11]、液相色譜串聯質譜法[12-14]、離子色譜法[15]、電化學法[16]、光度法[17]、拉曼光譜法[18]等。乳粉中乙基麥芽酚的檢測前處理過程多采用水相提取稀釋凈化后分析，存在檢測限較高，基質效應較強等缺點[11-12]。本文采用水-醚體系對乳粉樣品進行提取，經堿液反萃后采用固相萃取進行凈化和濃縮后液相色譜串聯質譜分析，以期建立一種靈敏度高、準確可靠的嬰幼兒乳粉中乙基麥芽酚的檢測方法，保障乳粉質量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、甲酸、二氯甲烷均為色譜純，美國TEDIA公司；鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉，均為分析純，廣州化學試劑廠；乙基麥芽酚（純度≥99%），美國Sigma公司。

HSS T3色譜柱（150×2.1 mm,2.5 μm,美國Waters公司）；C18固相萃取柱（3 mL）美國安捷倫公司；HLB固相萃取柱（3 mL）美國Waters公司；TQD超高效液相色譜-質譜聯用儀，美國Waters公司；KQ3200DE超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；MS3渦旋儀，德國IKA公司；320 R低溫離心機，德國Hettich公司；Advantage A10超純水凈化儀，美國Millipore公司；Genevac EZ-2型溶劑蒸發工作站，英國SP Scientific公司。乳粉樣品選用一段乳粉，市售。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理方法

稱取2 g試樣（精確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL溫度為50℃的水，轉速為3 000 r/min渦旋混勻2 min，溫度40℃下超聲提取15 min，超聲頻率為37 kHz，再加入10.0 mL叔丁基甲醚，轉速3 000 r/min渦旋混勻3 min,再加入10 g無水硫酸鈉除水，轉速3 000 r/min渦旋混勻2 min，轉速9 000 r/min離心3 min，吸取上清液5 mL轉移至另一離心管中，再加入5 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液反萃，轉速3 000 r/min渦旋混勻1 min后，轉速3 000 r/min離心3 min，用移液器準確移取下層清液到試管中，溫度40℃下用Genevac EZ2溶劑蒸發工作站濃縮20 min以除去微量的叔丁基甲醚，用鹽酸調節pH值至3.0，過柱。先后加入3 mL甲醇，3 mL超純水活化固相萃取柱，然后上樣，重力過柱后，用5 mL純水淋洗，棄去淋洗液，接著用5 mL注射器抽至凈干。最后用0.9 mL甲醇洗脫，接收洗脫液后用甲醇定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-質譜測定。

1.2.2 色譜-質譜條件

色譜柱為HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm,2.5 μm,Waters）；流速為0.4 mL/min；進樣體積為3 μL；柱溫為30℃；流動相：A相為甲醇，B相為0.05%甲酸水，梯度洗脫程序為0～2.0 min，20%A，2.0～2.1 min，20%A～80%A，2.1～4.0 min，80%A，4.0～4.1 min，,80%A～98%A，4.1～5.0 min，98%A，5.0～6.0 min，98%A～20%A。

MS條件：電噴霧正離子源(ESI+)，毛細管電壓：3.0 kV，離子源溫度：150℃，脫溶劑管度：350℃；霧化氣：150 L/hr氮氣；干燥氣：650 L/hr氮氣；碰撞氣：氬氣。掃描模式：多反應監測模式(MRM)，具體條件見表1。

表1 質譜參數

1.3 數據處理

通過Masslynx工作站及數據處理系統分析采集分析質譜圖，外標法定量。試驗結果采用平均值表示，每個試驗平行3次，采用Excel2010進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 色譜-質譜條件的優化

本文比較了水-乙腈和水-甲醇流動相體系,發現以水-甲醇作為流動相時,乙基麥芽酚定量定性離子對的響應明顯優于水-乙腈流動相體系。并在此基礎上考察了甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水對色譜峰的影響，發現添加甲酸后，質譜響應增強，0.05%甲酸水和0.1%甲酸水響應無顯著差別，故最終采用甲醇-0.05%甲酸水作為流動相。配置1 μg/mL的乙基麥芽酚標準液于進樣瓶中，采用儀器自動進樣進入質譜儀，在Masslynx軟件中設置質譜條件，并對標準液進行離子調諧，確定母離子(m/z為141.1)對應的最佳質譜條件，根據響應穩定、信號強度較高碎片確定定量離子對（141.1＞126.1）和定性離子對（141.1＞71.1）。

2.2 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱填料對目標物的吸附和洗脫能力有重要的影響，本實驗通過配制0.1 μg/mL乙基麥芽酚水溶液，經過上柱淋洗洗脫步驟后收集洗脫液分析，考察C18柱和HLB柱對乙基麥芽酚的富集效果。結果表明C18柱回收率約為20%，HLB柱的回收率超過90%，因此本實驗選用HLB柱作為富集凈化柱。

2.3 固相萃取柱條件的確定

由于分取的水相液體為堿性，因此本次實驗研究不同pH值是否對固相萃取柱的富集效果有影響。試驗用鹽酸和氫氧化鈉配制系列pH(pH 1～13)的溶液。向5 mL不同pH值水溶液中添加乙基麥芽酚標準溶液10 ng，上柱，淋洗、1 mL甲醇洗脫，收集洗脫液上機分析。不同pH條件下洗脫液中的乙基麥芽酚回收率見圖1，由圖可知，在酸性及中性的條件下，HLB柱可實現對乙基麥芽酚的富集，在堿性條件下，HLB柱對乙基麥芽酚的富集效果十分不理想，這是由于乙基麥芽酚呈弱酸性，在堿性條件下發生離子化使其在HLB柱上的吸附變弱。因此在取出堿性液體后，需要用鹽酸調節pH值至酸性條件，再進行過柱凈化。

圖1 不同pH值標樣固相萃取回收率情況

然而，在實際樣品檢測過程中，樣品經過前處理過程后，取出含有標樣的堿液5 mL，經HCl調節pH值至3.0后，過柱，洗脫后回收率低于20%，于是收集過柱液、淋洗液、洗脫液分別進行測定，結果發現過柱液和淋洗液中含有大量的乙基麥芽酚。這是由于堿液中含有微量的叔丁基甲醚，其在上樣和淋洗過程中會帶出乙基麥芽酚。本實驗嘗試采用二氯甲烷萃取除去水中微量叔丁基甲醚及通過劑蒸發工作站除去叔丁基甲醚兩種方式處理，再取水相調節pH后過柱，各階段溶液中乙基麥芽酚含量見表2，結果表明，經過二氯甲烷萃取過后的水相在過柱時不會有乙基麥芽酚損失，但是在淋洗過程仍有大量目標物會隨著水進入到淋洗液中，而采用溶劑蒸發工作站除去叔丁基甲醚后，僅在洗脫液中有乙基麥芽酚，回收率超過90%，故最終實驗選擇先用溶劑蒸發工作站除去叔丁基甲醚后再進行固相萃取柱凈化和濃縮。在此條件下，對應的樣品和加標樣品譜圖見圖2。

表2 樣品過柱過程各階段溶液中乙基麥芽酚含量

圖2 標準溶液和乳粉樣品MRM圖

2.4 基質效應

采用液質聯用分析復雜基質時通常存在基質效應，基質效應對液質檢測有重要影響[19]，因此需要考察本方法的基質效應。以甲醇溶劑和空白基質配制2～100 ng/mL標準曲線，根據兩條曲線的斜率計算基質效應，基質效應（ME）=（1-空白基質配制配制標準曲線的斜率/溶劑配制標準曲線的斜率）×100%[20]?？瞻谆|配制配制標準曲線方程為：Y=205.01X+196.67，溶劑配制標準曲線的方程為Y=179.53X+101.23，基質效應為12.5%。說明乳粉基質對乙基麥芽酚有基質抑制效應，基質效應微弱。本實驗基質效應遠低于寧宵等采用的凈化方法，這可能是由于本方法采用有機溶劑提取，可除去大量的水溶性物質，大大降低基質效應。

2.5 線性范圍和定量限

以空白基質液配制系列標準溶液，（質量濃度范圍為2.0～100 ng/mL），在本方法所確定的實驗條件下進行分析，以峰面積為縱坐標，標準工作液質量濃度為橫坐標作圖建立標準曲線，線性方程為:Y=205.01X+196.67，相關系數大于0.999。根據10倍信噪比，并計入試樣量和定容體積，計算定量限，定量限為2.0 μg/kg。

2.6 加標回收實驗

在上述確定的色譜條件和前處理條件下，進行5個不同濃度水平的添加回收實驗，其回收率與精密度見表3，從表中可以看出，乙基麥芽酚在5種不同添加水平下，其回收率都比較穩定，在71.2%～110.4%之間，相對標準偏差均小于10%，說明本方法檢測穩定性較好。

表3 嬰幼兒乳粉中乙基麥芽酚加標回收結果

3 結論

綜上所述，本文建立了固相萃取-超高效液相色譜質譜測定嬰幼兒乳粉中乙基麥芽酚含量，前處理采用水-叔丁基甲醚提取，氫氧化鈉溶液反萃后用溶劑蒸發工作站除去微量叔丁基甲醚后，再經HLB固相萃取柱實現同步凈化和濃縮。結果表明該法具靈敏度高、檢測結果可靠等優點，易于推廣，有望為相關檢測標準的建立提供依據。