河北中醫(yī)學(xué)院

楊偉麗 劉艷蕊 王 芮 魯 琴 王 茜 柴天川△(石家莊 050091)

提要 目的：通過觀察地黃對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶、生物鐘基因Clock及 Bmal1表達(dá)的影響，探索地黃改善失眠及學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制。方法：將60只昆明小鼠隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、陽(yáng)性藥組、生地黃組。除正常組外，其他各組腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)以制備睡眠剝奪模型。采用翻正反射實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間；尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)檢測(cè)小鼠收縮壓、舒張壓和心率；Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力； Real time-qPCR法檢測(cè)視交叉上核(SCN)中Clock、Bmal1 mRNA的表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)SCN中Clock、Bmal1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與正常組小鼠比較，模型組小鼠睡眠發(fā)生率無變化、睡眠潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，睡眠時(shí)間呈現(xiàn)縮短的趨勢(shì)；與模型組小鼠比較，藥物治療組小鼠睡眠發(fā)生率提高，睡眠潛伏期縮短，睡眠時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)。與正常組小鼠比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)較為顯著，航行的總路程變長(zhǎng)，穿過平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)變少(P<0.05，P<0.01)；與模型組小鼠比較，藥物治療組小鼠的逃避潛伏期和行走的總路程縮短較為顯著(P<0.05，P<0.01)，穿過平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)增多。與正常組小鼠比較，模型組小鼠的收縮壓、舒張壓和心率有升高趨勢(shì)；與模型組小鼠比較，藥物治療組小鼠收縮壓、舒張壓和心率有降低趨勢(shì)。與正常組小鼠比較，模型組小鼠Clock和Bmal1的mRNA、蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組小鼠比較，藥物治療組Clock和Bmal1的mRNA、蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。結(jié)論：生地黃能夠有效縮短睡眠剝奪小鼠的睡眠潛伏期，明顯延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)間，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力，具有鎮(zhèn)靜催眠的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SCN中Clock和Bmal1的表達(dá)有著密切關(guān)系。

失眠，又稱之為“不寐”，主要表現(xiàn)為睡眠時(shí)間、深度的不足，輕者入睡困難，或寐而不酣，時(shí)寐時(shí)醒，或醒后不能再寐，重則徹夜不寐[1]。失眠癥在人群中普遍可見，流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)各類睡眠障礙者約占總?cè)丝诘?8%，高于世界27%的比例，失眠患者占睡眠障礙患者的95%以上[2]。生地黃的原植物為玄參科植物地黃[Rehmanniaglutinosa(Gaert.) Libosch.,]用藥部位為其干燥塊根，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效[3]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，地黃有抗抑郁、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，改善認(rèn)知和記憶能力的作用[4-6]。生物鐘是肌體一種內(nèi)源性的調(diào)控系統(tǒng)，與睡眠有著密切的關(guān)系[7]。視交叉上核(SCN)內(nèi)的生物鐘調(diào)節(jié)基因種類繁多，其中與失眠聯(lián)系緊密的有生物鐘基因Clock、時(shí)鐘管理基因 Bmal1、晶體蛋白基因Cry1和Cry2、系列周期基因Per1、Per2、Per3等[8]。相關(guān)研究顯示[9]，睡眠剝奪小鼠SCN中生物鐘基因Clock和Bmal1表達(dá)增高。前期研究表明[10]，地黃具有鎮(zhèn)靜安神的功效，但其改善失眠的作用是否與調(diào)節(jié)Clock、Baml1有關(guān)尚不明確。因此，本研究采用對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)法復(fù)制睡眠剝奪模型，RT-qPCR法和免疫組化法檢測(cè)SCN中Clock和Bmal1的表達(dá)，來探究地黃改善失眠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量為(20±2)g，許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，溫度和濕度保持恒定，光照采用12 h黑白循環(huán)，自由進(jìn)食進(jìn)水。本實(shí)驗(yàn)已通過河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的審查，批準(zhǔn)號(hào)：DWLL2019004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 生地黃配方顆粒(廣東一方制藥有限公司，批號(hào)：0071943)；地西泮片(河北省中醫(yī)院，批號(hào)：20200402)；對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA，美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：1001542324)；戊巴比妥鈉(德國(guó)進(jìn)口分裝，批號(hào)：020402)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠Moriss水迷宮視頻分析系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；動(dòng)物無創(chuàng)血壓分析系統(tǒng)(美國(guó)visitech)；SHA-B恒溫振動(dòng)器(常州國(guó)華電器有限公司)；1-15K高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，MDF-382E超低溫保存箱(日本三洋)；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(英國(guó)BIO-RAD公司)；TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；MK3FC酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thomer Fisher公司)。

1.4 分組、造模及給藥 昆明小鼠60只首先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥組、生地黃組，各組15只。模型組及各給藥組每天隨機(jī)給予夾尾2 min、冷水浴3 min、晝夜顛倒24 h、鼠籠45°傾斜24 h、交替鼠籠24 h、禁食不禁水24 h等外界刺激中的2種，連續(xù)4周，于最后1周的第4 d開始，連續(xù)3 d腹腔注射PCPA混懸液(450 mg/kg)，1次/d。正常組腹腔注射等劑量的生理鹽水。生地黃組小鼠灌胃給予含生藥量為2.25 g/kg的生地黃溶液；陽(yáng)性藥組灌胃給予1.38 mg/kg的地西泮溶液；正常組和模型組小鼠灌胃給予等量的生理鹽水。用藥體積為0.01 mL/g，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.5.1 翻正反射實(shí)驗(yàn)：末次給藥后，隨機(jī)從各組中選出8只小鼠腹腔注射3.5 mg/mL戊巴比妥鈉水溶液，記錄30 min內(nèi)小鼠入睡數(shù)量，得出睡眠發(fā)生率。各組剩余的7只小鼠腹腔注射4.5 mg/mL戊巴比妥鈉水溶液，記錄30 min內(nèi)小鼠的睡眠潛伏期以及睡眠的持續(xù)時(shí)間。其中戊巴比妥鈉用藥體積為0.01 mL/g。將小鼠于仰臥位放置，超過1 min無法翻正，即認(rèn)為翻正反射消失，翻正反射消失為發(fā)生睡眠，翻正反射恢復(fù)為覺醒。睡眠潛伏期為從戊巴比妥鈉注射時(shí)開始至翻正反射消失的時(shí)間，睡眠時(shí)間為翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)的時(shí)間。

1.5.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：給藥1周后，應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組小鼠的空間記憶及學(xué)習(xí)能力[11-12]。

Morris水迷宮訓(xùn)練分為2部分。第1部分為定位航行實(shí)驗(yàn)：整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域劃分為4個(gè)象限，每個(gè)象限壁上貼有不同顏色圖案的標(biāo)志性卡片，將各組小鼠分別從各象限依次入水訓(xùn)練，使其能夠自由地尋找平臺(tái)區(qū)域，觀察其產(chǎn)生的路徑圖并記錄其到達(dá)平臺(tái)區(qū)域所用的時(shí)間，此時(shí)間命名為逃避潛伏期。時(shí)間限定為1 min，若未到達(dá)平臺(tái)區(qū)域，記錄其逃避潛伏期為1 min，并且將其引導(dǎo)至平臺(tái)區(qū)域停留10 s，持續(xù)訓(xùn)練5 d。第2部分為空間探索實(shí)驗(yàn)：在平臺(tái)區(qū)域所在象限對(duì)側(cè)象限的中點(diǎn)作為入水點(diǎn)，面向池壁入水，記錄小鼠到達(dá)平臺(tái)區(qū)域所用的時(shí)間，判斷各組小鼠的記憶能力。

1.5.3 小鼠血壓、心率的檢測(cè)：末次給藥30 min后，運(yùn)用動(dòng)物無創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)量各組小鼠的收縮壓、舒張壓及心率，此過程中需要同一人進(jìn)行操作。

1.5.4 Real time-PCR檢測(cè)下丘腦SCN中Clock、Bmal1表達(dá) 取SCN組織10 mg，用Trizol提取組織樣本中總RNA，測(cè)定RNA質(zhì)量和濃度。按產(chǎn)品說明書的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃、10 min預(yù)變性；95 ℃ 、10 s，58 ℃ 、60 s，完成40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢，得到目的基因及內(nèi)參基因β-actin的Cq值，目的基因Cq值-β-actin Cq值=ΔCq；按照公式Q=2-ΔCq計(jì)算得到各目的基因的Q值及其均值，按照公式RQ值=Q值/Q均值計(jì)算得到各目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)。Clock、Bmal1及內(nèi)參β-actin 序列見表1。

表1 Clock、Bmal1和β-actin的引物序列表

1.5.5 免疫組化法檢測(cè)下丘腦SCN中Clock、Bmal1表達(dá)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭并迅速在冰上分離出下丘腦，在4%多聚甲醛中固定48 h。石蠟包埋，切片，脫水處理；滴加一抗Clock(1∶200)和Bmal1 (1∶100)，室溫孵育1 h；然后滴加二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 min；PBS沖洗；DAB顯色液孵育5 min；水洗、復(fù)染、脫水、透明。鏡下觀察切片，從每組切片中隨機(jī)選取5個(gè)高倍(×400)視野，用Image Pro Plus 6.0對(duì)圖像進(jìn)行處理并獲取平均光密度(OD)值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組小鼠睡眠發(fā)生率、睡眠潛伏期、睡眠時(shí)間的比較 與正常組小鼠相比較，模型組小鼠睡眠發(fā)生率無變化、睡眠潛伏期延長(zhǎng)較為顯著(P<0.05)，小鼠的睡眠時(shí)間呈現(xiàn)縮短的趨勢(shì)；與模型組小鼠相比較，藥物治療組小鼠睡眠發(fā)生率提高，睡眠潛伏期縮短，睡眠時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組睡眠發(fā)生率、睡眠潛伏期、睡眠時(shí)間的比較

2.2 各組小鼠水迷宮逃避潛伏期、總路程、穿越平臺(tái)次數(shù)比較 與正常組小鼠比較，模型組小鼠的逃避潛伏期及總路程延長(zhǎng)較為顯著，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05，P<0.01)；與模型組小鼠比較，藥物治療組小鼠逃避潛伏期和總路程明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)。詳見表3。

表3 各組小鼠水迷宮逃避潛伏期、總路程、穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.3 各組小鼠收縮壓、舒張壓以及心率的比較 與正常組小鼠比較，模型組收縮壓、舒張壓和心率有升高的趨勢(shì)；與模型組小鼠比較，給藥組收縮壓、舒張壓和心率有降低的趨勢(shì)，但差異均無顯著性(P>0.05)。詳見表4。

2.4 各組小鼠SCN中Clock和Bmal1表達(dá)的比較 與正常組小鼠相比較，模型組小鼠Clock和Bmal1兩者的mRNA、蛋白表達(dá)水平升高顯著(P<0.05)；與模型組小鼠相比較，給藥組Clock和Bmal1的mRNA、蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。詳見表5～表6、圖1～圖2。

表4 各組小鼠收縮壓、舒張壓、心率的比較

表5 各組小鼠SCN中Clock，Bmal1 mRNA表達(dá)的比較

表6 各組小鼠SCN中Clock，Bmal1的平均OD值比較

圖1 生地黃對(duì)睡眠剝奪小鼠SCN中Clock蛋白表達(dá)的影響(×400)

圖2 生地黃對(duì)睡眠剝奪小鼠SCN中Bmal1蛋白表達(dá)的影響(×400)

3 討論

良好的睡眠覺醒周期能夠有效消除肌體疲勞、增強(qiáng)免疫，并且對(duì)情緒調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能具有不可替代的調(diào)控作用[13]。失眠不僅可以造成認(rèn)知障礙，還能夠影響人的學(xué)習(xí)記憶能力。研究表明[14]，PCPA是一種5-羥色胺的合成抑制劑，腹腔注射于小鼠體內(nèi)，能夠抑制小鼠大腦內(nèi)5-羥色胺的合成，導(dǎo)致睡眠晝夜節(jié)律消失，以致完全失眠，此模型造模時(shí)間較短，可重復(fù)性較強(qiáng)，是目前國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)的失眠模型[15]。PCPA可損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，Morris水迷宮是檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的常見評(píng)估工具，本研究結(jié)果顯示：PCPA所致的模型組小鼠逃避潛伏期較長(zhǎng)，總路程較長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)較少，說明模型組失眠小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減弱。給藥后，生地黃組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，在池中航行的總路程顯著性縮短，在平臺(tái)區(qū)域穿越的次數(shù)也呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，定位航行能力有了明顯改善。因此，可以推測(cè)出失眠導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知能力下降，而生地黃能夠有效的改善失眠小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

有研究表明，地黃在抗焦慮，抗抑郁[3]，鎮(zhèn)靜催眠[16]方面有一定的作用。戊巴比妥鈉協(xié)同實(shí)驗(yàn)方法為探討中藥治療失眠作用的經(jīng)典方法，該方法將小鼠翻正反射消失作為觀察的指標(biāo)[17]。有關(guān)研究顯示，有鎮(zhèn)靜催眠功效的藥物均能有效縮短戊巴比妥鈉閾上劑量誘導(dǎo)的小鼠睡眠潛伏期，提高閾下劑量誘導(dǎo)的睡眠發(fā)生率，延長(zhǎng)睡眠持續(xù)時(shí)間[18]。本研究結(jié)果顯示，生地黃能夠有效地提高小鼠的睡眠發(fā)生率，縮短其睡眠潛伏期，延長(zhǎng)其睡眠時(shí)間，尤其在縮短睡眠潛伏期方面作用明顯。提示地黃能夠在一定程度上發(fā)揮促進(jìn)睡眠的作用。

睡眠-覺醒活動(dòng)受睡眠節(jié)律基因的調(diào)控，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，生物鐘系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，是由SCN和附屬的外周生物鐘系統(tǒng)組成[19]。Clock、Bmal1基因是SCN中的2類興奮性調(diào)節(jié)基因，若其表達(dá)增高，則會(huì)引起神經(jīng)興奮性的增強(qiáng)，從而造成睡眠質(zhì)量下降、睡眠時(shí)間減少[20-21]。Clock基因的主要作用是維持睡眠的穩(wěn)態(tài)，是最先被發(fā)現(xiàn)的生物鐘基因[22-23]。當(dāng)Clock基因突變時(shí)，小鼠會(huì)極度興奮、睡眠時(shí)間減少, 多巴胺能神經(jīng)元活性會(huì)增加[24-25]。Bmal1基因是轉(zhuǎn)錄起始的主要調(diào)節(jié)因子，并激活晝夜節(jié)律生物鐘基因表達(dá)[22]，其缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠活動(dòng)節(jié)律紊亂[26-27]。本研究結(jié)果顯示，睡眠剝奪的模型復(fù)制成功后，小鼠SCN中Clock、Bmal1基因和蛋白的表達(dá)水平升高；給予生地黃進(jìn)行治療后，兩者的基因和蛋白表達(dá)水平明顯降低。提示生地黃可能通過降低SCN中Clock、Bmal1兩者的基因、蛋白水平的表達(dá)來治療失眠。

綜上所述，生地黃能夠有效縮短睡眠剝奪小鼠的睡眠潛伏期，并且能夠明顯延長(zhǎng)睡眠剝奪小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力，可能與調(diào)節(jié)SCN中Clock和Bmal1的表達(dá)有關(guān)，有待開展更系統(tǒng)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯考右则?yàn)證。