miR-155通過調(diào)節(jié)IL-21受體參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制初探

葛維維 吳黎明 陳再明 廖米榮

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，通常發(fā)生在嬰兒早期，AD發(fā)病歸因于環(huán)境因素、宿主易感基因、免疫系統(tǒng)失調(diào)等多因素相互作用［1］。MicroRNA（miRNA）是一類小的非編碼 RNA，參與機(jī)體眾多生物學(xué)過程［2］。人T輔助細(xì)胞系Jurkat是近年來發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群［3-4］，其可能參與包括AD在內(nèi)的多種自身免疫性疾病發(fā)病過程［5］。既往研究揭示眾多miRNA在免疫和炎性疾病中的作用，其中miR-155可通過下調(diào)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA-4）增加T輔助細(xì)胞增殖反應(yīng)，從而導(dǎo)致慢性哮喘發(fā)病［6］。產(chǎn)生白介素（IL）-21的T輔助細(xì)胞（Th21）是最近鑒定出的CD4+T輔助細(xì)胞亞群，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中起重要作用，并參與包括AD在內(nèi)的各種自身免疫和炎性疾?。?-8］。動物實驗研究顯示，缺乏miR-155的小鼠無法發(fā)展為實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE），而在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，miR-155敲除小鼠對抗原特異性Th21細(xì)胞反應(yīng)具有抗性［9］。本研究探討miR-155是否通過調(diào)節(jié)IL-21受體參與AD的發(fā)病，為AD的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2020年5月臺州市第二人民醫(yī)院急性AD患者110例為觀察組，根據(jù)Rajka定義的標(biāo)準(zhǔn)確診，并使用SCORingAD（SCORAD）指數(shù)評估疾病的嚴(yán)重程度。納入標(biāo)準(zhǔn)：①近6個月未接受過全身性糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療；②近1個月AD患者無疫苗接種；③近2周無感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤者；②合并自身免疫性疾??；③其他皮膚病。同時選取健康體檢者102例為對照組。兩組一般情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。本項目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者及家屬知情同意。

表1 兩組一般情況比較

1.2 方法 （1）外周血Jurkat細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA水平測定：通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心從500 μL外周血中分離出Jurkat細(xì)胞，使用RNAiso Plus提取Jurkat細(xì)胞RNA，并在20 μL反應(yīng)系統(tǒng)中使用Trans Script Green一步qRT-PCR SuperMix通過一步qRT-PCR檢測基因的相對表達(dá)，qRT-PCR反應(yīng)條件為：45 ℃，5 min ；94 ℃，30 s；（94℃，5 s；60℃，30 s）×40個循環(huán)，用2-△△Ct法分析靶基因表達(dá)量。（2）外周血CD44、IL-4、IL-10、TNF-α、hs-CRP、Th21測定：流式細(xì)胞儀（AttuneNxT，美國熱電）檢測CD44、Th21細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例（抗體購于上海玉博生物科技有限公司，批號：5632456、8546296），相應(yīng)試劑盒評估參與者外周血中IL-4、IL-10、TNF-α、hs-CRP的水平（MSKBIO中國，武漢），使用Multiskan Sky酶標(biāo)儀檢測樣品光密度值。（3）細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)及分組：在含有10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640（美國Gibco）培養(yǎng)基中培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞，根據(jù)制造商的說明，用lipofectamine 2000（美國Invitrogen）轉(zhuǎn) 染Jurkat細(xì) 胞。miR-155 NC組、miR-155 mimics組、miR-155 inhibitor組培養(yǎng)方法：miRNA載體包括miR-155 NC載體（無miR-155表達(dá)）、miR-155過表達(dá)載體（mimics），miR-155低表達(dá)載體（miR-155 inhibitor組）（購自RiboBioCo，中國廣州）。其載體序列分別為：5'-TGCGTGACTGAACTGACTGGACTGAC TG-3'；5'-TGCGTGACTGCAATGCGTGACTGC-3'。使用Lipofectamine2000試劑根據(jù)質(zhì)粒進(jìn)行差異轉(zhuǎn)染，各組設(shè)6個平行樣，培養(yǎng)72 h。（4）Jurkat細(xì)胞活力、凋亡測定：將細(xì)胞以1×103/孔的濃度鋪在96孔板上，庫爾特計數(shù)器孵育1天后對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)，并使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）計算細(xì)胞增殖率，酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度評估細(xì)胞活力。通過胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，并根據(jù)說明將其重懸于100 μLAnnexin V Binding Buffer中。將5 μL FITC Annexin V添加到細(xì)胞中，然后添加10 μL碘化丙啶（PI）。在室溫下孵育15 min后添加400 μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液，通過FC500MCL流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。（5）Jurkat細(xì)胞IL-21R蛋白表達(dá)水平測定：將RIPA裂解試劑添加到細(xì)胞沉淀中，在冰上裂解15 min后，提取蛋白質(zhì)上清液。通過雙辛可寧酸（BCA）測定蛋白質(zhì)量濃度后，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上電泳分離蛋白40 μg，電泳至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（250 mA，100 min），在室溫下封閉放置60 min，并與一抗（IL-21R，β-肌動蛋白稀釋比例為1∶2,000、1∶1,500）在4℃下過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水和Tween-20（PBST）洗滌3次后，加入HRP偶聯(lián)的二抗（1∶5,000，60 min），然后用PBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光溶液可視化蛋白質(zhì)條帶。使用GS-900TM校準(zhǔn)密度計定量密度，并使用ImageLab（BioRad）進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，兩組比較采用t檢驗，三組比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，相關(guān)分析采用Pearson積差相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-155、IL-21R mRNA及炎癥指標(biāo)比較 觀察組miR-155、IL-21R mRNA、IL-4、hs-CRP、TNF-α、CD44、Th21、IL-21 水平高于對照組（P＜0.05）。

表2 兩組miR-155、IL-21R mRNA及炎癥指標(biāo)比較（）

表2 兩組miR-155、IL-21R mRNA及炎癥指標(biāo)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05

指標(biāo) 對照組（n=102） 觀察組（n=110）miR-155mRNA 0.86±0.48 3.58±0.39*IL-21R mRNA 1.23±0.39 4.59±0.39*IL-4（pg/mL） 8.89±4.54 19.59±3.36*hs-CRP（μmol/L） 328.47±10.29 467.59±12.84*TNF-α（pg/mL） 4.59±2.48 39.85±5.48*CD44（%） 72.59±3.96 82.45±5.86*Th21（%） 2.30±0.58 3.96±0.39*IL-21（pg/mL） 5.54±2.69 16.96±3.55*

2.2 miR-155與各變量的相關(guān)性分析 miR-155與TNF-α、IL-4、IL-21、TH21、IL-21R mRNA、hs-CRP、CD44正相關(guān)（r=0.458、0.563、0.489、0.539、0.636、0.574、0.669，P=0.004、0.001、0.030、0.020、0.003、0.007、0.010）。

2.3 各組Jurkat細(xì)胞OD值、存活率和凋亡率比較 與Jurkat組比較，miR-155 NC組OD值、存活率、凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與Jurkat組比較，miR-155 mimics組OD值、存活率升高，凋亡率降低，miR-155 inhibitor組OD值、存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；與miR-155 mimics組比較，miR-155 inhibitor組OD值、存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）。見表3、圖1～2。

表3 各組Jurkat細(xì)胞OD值、存活率、凋亡率比較

圖1 各組Jurkat克隆形成數(shù)目比較

圖2 各組Jurkat細(xì)胞凋亡率比較

2.4 各組Jurkat細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA表達(dá)水平比較 與Jurkat組比較，miR-155 NC組miR-155、IL-21R mRNA和蛋白無明顯變化（P＞0.05）；與Jurkat組比較，miR-155 mimics組細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白升高，miR-155 inhibitor組細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05）；與miR-155 mimics組比較，miR-155 inhibitor組細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 各組Jurkat細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組Jurkat細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白表達(dá)比較（）

注：與Jurkat組相比，*P＜0.05；與miR-155 mimics組比較，#P＜0.05

組別 復(fù)孔數(shù) miR-155 mRNA IL-21R mRNA IL-21R蛋白（/GAPDH）Jurkat組 6 1.83±0.18 1.39±0.39 0.93±0.18 miR-155 NC 組 6 1.80±0.20 1.36±0.30 0.94±0.18 miR-155mimics組 6 3.92±0.20* 3.81±0.37* 1.28±0.17*miR-155inhibitor組 6 0.63±0.21*# 0.77±0.43*# 0.53±0.16*#

圖3 各組Jurkat細(xì)胞IL-21R蛋白比較

3 討論

AD是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，影響全世界約20%的兒童。該病表現(xiàn)出高度的病理生理異質(zhì)性，導(dǎo)致相似的濕疹性皮膚病灶。皮膚組織中高水平表達(dá)的miR-155被鑒定為AD的組織標(biāo)志物，這改善分子診斷。然而，當(dāng)前診斷程序的侵入性、不便性限制其應(yīng)用。因此，需要鑒定用于檢測AD的新型非侵入性生物標(biāo)志物。最近，據(jù)報道在無細(xì)胞血漿中檢測到的miRNA可充當(dāng)將患病個體與健康對照區(qū)分開的標(biāo)記。由于血漿中miRNA的水平穩(wěn)定，可重復(fù)在同一物種的個體中保持一致。血漿miRNA的非侵入性及其在疾病中的敏感性促使人們尋求更多的miRNA生物標(biāo)志物。在血漿中已鑒定出約100種miRNA，這表明血漿miRNA包含多種疾病的信號，并可作為較多疾病的非侵入性診斷標(biāo)記［10］。

MicroRNA（miRNA，miRs）是短的內(nèi)源性非編碼RNA，通過翻譯抑制、mRNA失穩(wěn)或這兩種機(jī)制的組合抑制蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)。miRNA在免疫穩(wěn)態(tài)，淋巴譜系的發(fā)育和炎癥反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA的差異表達(dá)已在幾種免疫和炎癥疾病中得到證實。MiR-155在多種免疫細(xì)胞譜系表達(dá)［11］（包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞），其中一些與慢性皮膚炎癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。有報道m(xù)iR-155可以直接靶向促進(jìn)IL-21R［12］。miRNA通過與帶有互補(bǔ)位點的靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合而起作用。在人類中，根據(jù)生物信息學(xué)分析，IL-21R也是miR-155的靶基因，最近使用TaqMan低密度陣列（TLDA）研究表明，miR-155在AD病變中過表達(dá)，并主要在浸潤的免疫細(xì)胞中表達(dá)。本研究顯示，觀察組miR-155、IL-21R mRNA水平高于對照組，且miR-155與TNF-α、IL-4、IL-21、TH21、IL-21R mRNA、hs-CRP、CD44正相關(guān)（P＜0.05）。這與上述研究一致，同時也揭示miR-155、IL-21R在AD發(fā)病機(jī)制中具有重要調(diào)控作用。miR-155是AD皮膚中排名最高的miRNA之一（4.6倍上調(diào)）。研究表明，miR-155主要在浸潤的皮膚免疫細(xì)胞中表達(dá)，特別是在CD4+T輔助細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中表達(dá)。Th21細(xì)胞是最近鑒定出的CD4+T輔助細(xì)胞亞群，通過產(chǎn)生有效的細(xì)胞因子IL-21R，在自身免疫以及炎癥和過敏反應(yīng)的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13-14］，這些報道均與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，與Jurkat組比較，miR-155 mimics組OD值、存活率升高、細(xì)胞凋亡率降低，miR-155 inhibitor組OD值、存活率降低、細(xì)胞凋亡率升高；與miR-155mimics組比較，miR-155inhibitor組OD值、存活率降低、細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），表明，miR-155能明顯促進(jìn)炎癥細(xì)胞Jurkat增殖、抑制其凋亡。miR-155明顯增加培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞中Th21細(xì)胞的百分比，并促進(jìn)IL-21R的mRNA表達(dá)，以及無細(xì)胞上清液中IL-21R的蛋白濃度［15-16］。IL-21R是Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的激活、發(fā)育和分化，并參與免疫和炎癥性疾病。最近，通過表征IL-21R的模擬物，明確IL-21R對Th21細(xì)胞分化和功能的影響，IL-21R可促進(jìn)IL-6誘導(dǎo)的STAT3活化并激活Th21細(xì)胞的發(fā)育［17-18］。本研究顯示，與Jurkat組比較，miR-155 mimics組細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白升高，miR-155 inhibitor組細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低；與miR-155 mimics組比較，miR-155 inhibitor組單細(xì)胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05），這與前述討論一致。同時也表明在炎癥細(xì)胞Jurkat中，miR-155可能通過促進(jìn)IL-21R的表達(dá)進(jìn)而參與AD的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，AD患者miR-155、IL-21R表達(dá)水平升高，miR-155可能通過促進(jìn)IL-21R的表達(dá)進(jìn)而參與AD的發(fā)病。