Apelin通過UCP2減輕缺血再灌注對大鼠肺血管內皮細胞的損傷

陳超星 蔡瑤瑤 朱慧杰 夏芳芳

肺缺血/再灌注損傷（LIRI）系多因素所致肺缺血基礎上恢復灌注后，肺損傷加重的現象，主要表現為肺水腫和急性呼吸窘迫綜合征。肺上皮是限制各種毒性物質進入呼吸系統維持肺穩態的屏障，因此肺上皮細胞也被認為在防御感染和發病機制中起關鍵作用［1］。破壞肺泡上皮細胞可能會導致各種肺部疾病的發生發展，如慢性阻塞性肺疾病和急性肺損傷［2-3］。LIRI導致的多種炎性介質產生和釋放后使肺微血管通透性增加，誘發肺泡上皮細胞凋亡增加從而導致肺內皮功能障礙［4］。研究表明，Apelin-13干預通過誘導解耦聯蛋白2（UCP2）表達下調控制炎癥因子表達，減輕氧化應激反應和抑制凋亡反應從而減輕大鼠肺LIRI有關［5］。UCPs是一種線粒體內膜蛋白，廣泛分布于肺、腦、脾、腎等多種器官，且參與細胞各項生理功能，尤其在抗氧化應激反應發揮重要作用［6］。研究認為，UCP2參與減少活性氧自由基（ROS）的產生，并抑制ROS介導的肺上皮細胞凋亡［7］。本文探討Apelin對LIRI治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 原代SD乳鼠（2～3 d）購買于溫州醫科大學動物實驗中心。實驗過程及對動物的處置符合溫州醫科大學動物倫理要求。

1.2 方法 （1）SD乳鼠肺泡上皮細胞分離與培養：原代SD乳鼠肺上皮細胞培養：取出生2～3天的SD乳鼠，紫外光照射30 min，用75%乙醇浸泡消毒5 min，剪刀從劍突左緣剪開胸骨，用鑷子夾出肺組織置于PBS洗去血液，用組織剪去除盡可能多的表面胸膜，PBS混懸，待組織塊自然沉降后吸棄上清液，重復3～4次至上清液清亮，用剪刀剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，0.1%胰酶（美國Gibco公司，25200-072）37℃消化15～20 min，大部分組織塊被消化為細胞懸液，加適量含10%FBS（美國Gibco公司，10099-141）的DMEM（美國Gibco公司，C11995500BT）終止消化，用吸管充分吹打均勻，1,000 r/min離心10 min。棄去上清液，較均勻地接種在5 mL玻璃培養瓶上，加入上述DMEM培養液約0.5 mL于37℃，95%空氣+5% CO2培養箱過夜，次日加入2 mL培養液繼續培養。（2）實驗分組：培養細胞生長融合至80%左右時，更換無血清的高糖DMEM培養液饑餓細胞24 h，使細胞周期同步化，然后進行分組及藥物干預。將細胞培養基換成無糖培養基后，暴露于具有5%CO2和95%N2的缺氧室中，37℃下2 h，然后在95%O2和5%CO2恒溫培養箱中復氧2 h（細胞AR模型）。對照組（Con組）：肺上皮細胞不進行AR處理。AR組：將肺上皮細胞缺氧/復氧AR處理；Apl組（AR + Apelin）：肺上皮細胞復氧前給予Apelin（TOCRIS，217082-60-5）（3）CCK-8法檢測細胞增殖活性：將細胞接種到96孔培養板中，四周每孔加入100 μL無菌PBS防止邊緣效應。顯微鏡下觀察細胞生長至對數期，更換無血清培養基同步化12 h。按照分組造模后，棄掉培養基，每孔加入預先配置好的CCK-8工作液（日本DOJINDO公司，CK04，DMEM與CCK-8試劑按1∶9比例均勻混合）100 μL，在37℃恒溫培養箱中避光孵育1～2 h。酶標儀檢測波長為450 nm處的吸光度，記錄每個孔的OD值。（3）Westernblot法檢測UCP2蛋白表達：將細胞收取在適量的RIPA裂解緩沖液中。使用BCA蛋白測定試劑盒（碧云天生物科技公司，上海）對總蛋白進行定量，用10%SDSPAGE分離，將分離的條帶用濕轉法轉移到PVDF膜上，并用含5% 脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h。孵育UCP2 Antibody（Abcam，ab97931）以探測標記，再通過與山羊抗兔IgG（H+L）HRP孵育后加入ECL發光液將其可視化，從而檢測免疫反應帶。（4）ELISA法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的表達：根據制造商的說明（Bioscience，San Diego，CA），通過ELISA測定培養基的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）含量。將IL-1β、IL-6和TNF-α的量標準化為細胞的蛋白質濃度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料正態性采用Shapiro-Wilk檢驗。符合正態分布計量資料以（）表示，偏態分布計量資料資料用M（Q1，Q3）表示。多組比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett's T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度Apelin對肺上皮細胞LIRI細胞活力的影響 分別設立5個Apelin的濃度，分為7組：Con組、AR組、AR+Apelin0.5μmol/L組（A0.5組）、AR+Apelin 1μmol/L（A1組）、AR+Apelin 2μmol/L（A2組）、AR+Apelin 5μmol/L（A5組）、AR+Apelin 10 μmol/L（A10組）。與Con組比較，AR組肺上皮細胞的吸光度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；而與AR組比較，A2組、A5組、A10組中的肺上皮細胞吸光度增加（P＜0.05），但A2組的細胞活力最佳。見表1。

表1 不同濃度Apelin對肺上皮細胞LIRI細胞活力的影響（）

表1 不同濃度Apelin對肺上皮細胞LIRI細胞活力的影響（）

注：與Con組比較，*P＜0.05；與AR組比較，#P＜0.05

組別 OD 450 Con組 1 AR組 0.44±0.99*A0.5組 0.49±0.93*A1組 0.64±0.10*A2組 0.88±0.05*#A5組 0.90±0.09*#A10組 0.95±0.12*#

2.2 3組乳鼠肺上皮細胞UCP2蛋白表達比較 與Con組比較，AR組肺上皮細胞UCP2蛋白表達下調，差異有統計學意義（P＜0.05），與AR組比較，Apl組肺上皮細胞UCP2蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組小鼠肺上皮細胞UCP2蛋白表達比較

2.3 3組肺上皮細胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達比較 與Con組比較，AR組肺上皮細胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與AR組比較，Apl組肺上皮細胞IL-1β、IL-6和TNF-α表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

表2 3組肺上皮細胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達比較（）

表2 3組肺上皮細胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達比較（）

注：與Con組比較，*P＜0.05；與AR組比較，#P＜0.05

組別 IL-1β（pg/mL） IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL）Con 組 82.81±4.56 25.86±2.54 161.77±8.26 AR 組 107.13±5.51* 60.72±3.56* 210.70±9.65*Apl組 85.86±5.70# 35.94±6.21*# 181.29±6.12*#F值 18.87 50.21 27.45 P值 0.003 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

本研究結果表明，缺氧復氧損傷會導致肺上皮細胞活力降低、炎癥反應增加以及UCP2蛋白表達降低，而Apelin能改善肺上皮細胞缺氧復氧的損傷，減少炎癥反應，增加UCP2蛋白的表達。提示，UCP2參與調控Apelin對肺上皮細胞缺氧復氧的保護機制。

LIRI仍是肺移植術后的主要問題之一。LIRI導致微血管通透性增加，肺中多形核中性粒細胞被隔離，以及肺泡內皮功能障礙。此外，肺泡上皮細胞的過度凋亡會損害上皮屏障［8］，并伴隨著肺泡上皮細胞的衰老和炎癥反應［9］。肺功能主要取決于肺泡上皮細胞［10］，因此本研究選擇了提取原代肺上皮細胞用于研究。

線粒體是產生氧化應激的主要來源，過多難以清除的ROS觸發炎性反應，最終導致肺血管內皮的損傷、肺水腫，影響肺功能，在肺缺血再灌注損傷中發揮重要作用［11-12］。UCPs位于線粒體內膜上，屬于線粒體陰離子轉運蛋白超家族，通過控制質子跨過線粒體內膜的泄漏使ATP合成過程和氧化磷酸化過程脫鉤［13］。UCPs是重要天然抗氧化劑，與清除酶（如超氧化物歧化酶和過氧化氫酶）和低分子量抗氧化劑（如抗壞血酸和谷胱甘肽）一起參與維持ROS穩態［14］。LUO等［15］研究認為，UCP2過表達能夠保護線粒體超微結構，抑制線粒體分裂，改善線粒體ATP合成。本資料結果顯示，缺氧復氧引起肺上皮細胞的活力降低和炎癥反應與UCP2蛋白的表達降低一致。

Apelin作為一種內源性配體，具有肺保護作用［16-17］。ZHANG 等［10］研究表明，Apelin-13 能夠通過減輕ROS反應改善博來霉素誘導的肺損傷過程中的線粒體功能障礙減輕肺損傷，從而抑制肺纖維化損傷的進展。而在另外一個急性肺損傷模型中，研究者從動物載體和細胞水平兩種途徑驗證Apelin-13能夠抑制ROS形成和炎性反應從而改善LPS誘導的急性肺損傷［17］。DUAN等［18］研究結果提示，Apelin能夠抑制I/R誘導的ROS介導的氧化應激和炎癥反應，從而誘導抗氧化酶的表達。文獻報道過Apelin可能降低白色和棕色脂肪組織中UCP1和肌肉組織中UCP3表達水平，從而導致肥胖和不孕［19］。提示Apelin能夠作用于UCP受體。本研究證實Apelin和UCP2受體的相互作用，發現Apelin能夠通過促進UCP2蛋白的表達降低氧化應激損傷和炎癥反應，減輕線粒體損傷，從而改善肺上皮細胞缺氧復氧損傷。

綜上所述，缺氧復氧損傷會導致肺上皮細胞活力降低、炎癥反應增加和UCP2蛋白表達下降，Apelin-13干預通過上調UCP2蛋白表達控制炎癥因子表達，減輕氧化應激反應從而減輕肺上皮細胞缺氧復氧導致的細胞損傷。