德宏州辣椒病毒病發(fā)生情況調查及其毒源種類

銀馨 岳元保 丁家盛 王根權 張培花 李翱 李學梅 段雪甜

摘要：對德宏州州內辣椒種植地區(qū)病毒病的發(fā)生情況進行了調查，發(fā)現在全州各縣市辣椒種植地均有病毒病的發(fā)生，發(fā)病癥狀主要以花葉、皺縮、落葉、落果、葉脈褐變、頂枯、畸形為主，單獨或混合發(fā)生，發(fā)病率在5%～30%，嚴重的達50%以上。對采自德宏州5個縣市的111份辣椒樣品進行了DAS-ELISA、Dot-ELISA檢測以及PCR檢測。檢測結果表明，在檢測的111份樣品中，有55份辣椒樣品感染了所檢測病毒，病毒檢出率為49.55%，病毒種類有13種，其中以番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spotted virus，TZSV）占29.10%，其次是番茄花葉病毒（Tomato masaic virus）占23.64%，煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）占9.09%，泰國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl Thailand virus，TYLCV）、煙草曲莖病毒DNA1衛(wèi)星、中國勝紅薊黃脈病毒和PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒）各占5.45%。

關鍵詞：辣椒病毒病;發(fā)病情況;ELISA檢測;PCR檢測

辣椒是茄科辣椒屬的一年生草本植物，是世界上一種重要的蔬菜作物和調味品[1]。辣椒富含粗蛋白、粗脂肪、辣椒素、辣椒堿、維生素、鈣和磷等物質，其中辣椒中維生素C含量居各種蔬菜作物之首。此外，辣椒的果實、根、莖枝均可入藥。辣椒素有“紅色藥材”之稱，能溫中散寒，健胃消食;外用能治凍瘡，風濕痛，腰肌痛[2-3]。

辣椒病毒病是辣椒生產過程中的災難性病害之一，常導致辣椒落葉、落花、落果，可減產30%～70%，甚至絕收。目前在全球范圍內，已發(fā)現40種以上的病毒能侵染辣椒。而且，辣椒病毒病的發(fā)生和危害呈逐年加重的趨勢[4-6]。為了明確云南省德宏州當前辣椒病毒病的毒株種類，以期全面掌握德宏州內的辣椒病毒病病源種類以及危害程度。于2015年底～2017年初，在德宏州的芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣、梁河縣5個縣市辣椒種植田塊進行辣椒病毒病發(fā)病情況的調查。并在實驗室內，利用DAS-ELISA和Dot-ELISA技術對德宏州5個縣市的采集的辣椒病毒病樣品進行了常見病毒的血清學檢測，同時利用PCR技術對20種辣椒病毒病進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年12月～2017年2月，在德宏州的芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣、梁河縣5個縣市辣椒種植田塊調查辣椒病毒病發(fā)病情況，采集典型病毒病癥狀的辣椒葉片、嫩梢和果實樣品，并對所采集的辣椒樣品進行統(tǒng)一編號和癥狀記載。將所采集的辣椒樣品分別裝入標記自封袋中，放入-20℃的冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒病原檢測

1.2.1 番茄斑萎病毒屬病毒檢測

采集感病的辣椒典型番茄斑萎病毒病害樣品分別用tospoviruses抗血清進行DAS-ELISA和dot-ELISA檢測，用于DAS-ELISA檢測的抗血清有INSV、IYSV和GRSV/TCSV復合抗血清購自美國Agdia公司。用于dot-ELISA的TZSV、GYSV、WSMoV、HCRV多克隆抗體由本實驗室制備，按1/3000進行稀釋，TSWV單克隆抗體由浙江大學周雪平教授提供，按1/3000進行稀釋。

1.2.2 菜豆金色花葉病毒屬病毒檢測

采用CTAB法提取典型雙生病毒病害癥狀病株葉片總DNA。利用菜豆金色花葉病毒屬病毒簡并引物PA/PB進行PCR檢測，該引物擴增的目的條帶為該屬病毒基因共同區(qū)及外殼蛋白保守區(qū)約500 bp的基因片段。與此同時，利用beta衛(wèi)星通用引物β01/β02和alpha衛(wèi)星通用引物UNA101/UNA102對雙生病毒典型病株進行PCR檢測，這兩對引物的目的條帶分別為其衛(wèi)星全長。PCR反應體系：10×PCR反應緩沖液（含Mg2+）2.5 μL、2.5 μmol/L dNTPs 2 μL、20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL、Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL，上海申能博彩生物科技有限公司）0.5 μL、植物總DNA 125 ng，加雙蒸水定容至25 μL。擴增條件：94℃預變性2 min;94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸50/90 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。紫外燈下割取目的片段，利用Axygen DNA凝膠回收試劑盒分離純化，回收產物連接到pGEM-T Easy（Promega，Madison，WI）載體上，通過熱擊法將連接產物轉入大腸桿菌DH5α中，挑選陽性克隆，委托上海立菲生物技術有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 辣椒病毒病的發(fā)生情況

根據2015～2017年田間調查結果，德宏州辣椒病毒病在德宏州芒市風平鎮(zhèn)、瑞麗市勐卯鎮(zhèn)、隴川縣景罕鎮(zhèn)、盈江縣舊城鎮(zhèn)等辣椒主產區(qū)均有發(fā)生，常見的發(fā)病類型有4種：（1）花葉型：病癥是葉、果出現不規(guī)則退綠、斑駁，嚴重時植株矮化，葉、果皺縮，果實難以轉紅或局部轉紅，僵化。（2）黃化型：病葉變黃，嚴重時形成上黃下綠，植株矮化并伴有明顯落葉。（3）壞死型：表現為葉片上呈現不規(guī)則的紅褐色和深褐色病斑、葉脈褐變壞死甚至頂枯。（4）畸形型：表現為葉片增厚、變小或呈蕨葉狀，植株節(jié)間縮短、矮化呈叢簇狀，病果畸形、凹凸不平，容易落果。主要以花葉和矮縮畸形混合發(fā)生比較普遍，壞死發(fā)生不成片，一般零星發(fā)生。

2.2 辣椒樣品的病毒種類分析

2015年12月～2017年2月在德宏州芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣、梁河縣5個縣市共采集了111份辣椒樣品。實驗室病毒病檢測結果顯示，有55份辣椒樣品檢出病毒，病毒檢出率為49.55%。實驗方法檢測的病毒種類共有20種，實驗檢出病毒種類13種，其中以番茄斑萎病毒屬的番茄環(huán)紋斑點病毒（TZSV）為主，占29.09%，其次是番茄花葉病毒，占23.64%，煙草曲莖病毒占9.09%，泰國番茄黃化曲葉病毒、煙草曲莖病毒DNA1衛(wèi)星、中國勝紅薊黃脈病毒和PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒）各占5.45%，煙草曲葉病毒、WSMoV（西瓜銀色斑駁病毒）和番茄黃化曲葉病毒各占3.64%，朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒、中國番茄黃化曲葉病毒和棉花曲葉病毒Beta衛(wèi)星各占1.82%（見圖1）。

瑞麗共檢測到7種病毒（表1，下同）。其中，番茄花葉病毒和TZSV（番茄環(huán)紋斑點病毒）檢出數均為11個樣品，占瑞麗市檢出總樣品的比率均為36.67%，是瑞麗辣椒上的優(yōu)勢毒源;其次煙草曲莖病毒、煙草曲莖病毒DNA1衛(wèi)星和中國勝紅薊黃脈病毒檢出數占瑞麗檢出總樣品的比率均為6.67%;朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒和PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒）檢出數占瑞麗檢出總樣品的比率均為3.33%。隴川共檢測到9種病毒。主要以TZSV（番茄環(huán)紋斑點病毒）為主，檢出數占隴川檢出總樣品的比率達21.43%;其次WSMoV（西瓜銀色斑駁病毒）、番茄花葉病毒和番茄黃化曲葉病毒檢出數占隴川檢出總樣品的比率均為14.29%;泰國番茄黃化曲葉病毒、煙草曲莖病毒、棉花曲葉病毒Beta衛(wèi)星、煙草曲莖病毒DNA1衛(wèi)星和中國勝紅薊黃脈病毒檢出數占隴川檢出總樣品的比率均為7.14%。盈江共檢測出4種病毒。主要以泰國番茄黃化曲葉病毒和煙草曲葉病毒為主，檢出數占盈江檢出總樣品的比率均為33.33%;其次是中國番茄黃化曲葉病毒和TZSV（番茄環(huán)紋斑點病毒），檢出數占盈江檢出總樣品的比率均為16.67%。芒市共檢測出3種病毒，以煙草曲莖病毒為主，檢出數占芒市檢出總樣品的比率為50.00%，其次是TZSV（番茄環(huán)紋斑點病毒）WSMoV（西瓜銀色斑駁病毒），檢出數占芒市檢出總樣品的比率均為25.00%。梁河檢測到1種病毒為PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒），檢出數占梁河檢出總樣品的比率為100.00%。

3 結論與討論

對德宏州州內辣椒種植地區(qū)進行了病毒病發(fā)生情況的調查，發(fā)現在全州各縣市辣椒種植地均有病毒病的發(fā)生，發(fā)病癥狀主要以花葉、皺縮、落葉、落果、葉脈褐變、頂枯、畸形為主，單獨或混合發(fā)生，發(fā)病率在5%～30%，嚴重的達50%以上。芒市風平鎮(zhèn)、盈江縣舊城鎮(zhèn)露地番茄黃化曲葉癥狀比較明顯，以點片發(fā)生為主。瑞麗市勐卯鎮(zhèn)、隴川縣景罕鎮(zhèn)大多數為大棚栽培，栽培管理比較好，辣椒病毒病發(fā)病較輕，發(fā)病率大部分在5%以下。這表明栽培管理措施是控制病毒病發(fā)生的關鍵因素。

本次共采集了111份辣椒樣品進行病毒病檢測，其中有55份辣椒樣品帶毒，病毒檢出率為49.55%，病毒種類有13種，結果表明德宏州的辣椒病毒種類較多，并且各縣市的病毒種類和優(yōu)勢毒源存在較大差異，TZSV（番茄環(huán)紋斑點病毒）是，芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣辣椒上的優(yōu)勢毒源，PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒）是梁河縣辣椒上的優(yōu)勢毒源。

已有研究表明，辣椒上的病毒種類很多[5]，由于本試驗采集樣品數量和檢測的病毒種類有限，因此引起本地區(qū)辣椒病毒病的毒源可能還有其他種類，這還需進一步的檢測鑒定。

參考文獻

[1] 劉易偉，胡文忠，姜愛麗，等.辣椒的營養(yǎng)價值及其加工品的研發(fā)進展[J].食品工業(yè)科技，2014，35（15）：377-381.

[2] 溫變英.辣椒的營養(yǎng)藥用價值及其開發(fā)利用[J].特種經濟動植物，2007（8）：38-39.

[3] 劉春艷.辣椒的食用價值[J].辣椒雜志，2006（4）：39.

[4] 汪沛，湯琳菲，雷艷，等.辣椒病毒病研究進展[J].湖南農業(yè)科學，2015（7）：151-154.

[5] 林燕春.辣椒病毒病發(fā)生規(guī)律與防治技術研究[J].湖北農業(yè)科學，2009（9）：2142-2144.

[6] 劉峰.辣椒病毒病發(fā)生規(guī)律與防治技術研究[J].江西農業(yè)學報，2009，21（6）：100-102.