條斑紫菜丙酮酸羧化酶基因表達對不同碳源的響應

劉雪瑩, 王廣策, 張寶玉, 宮相忠

條斑紫菜丙酮酸羧化酶基因表達對不同碳源的響應

劉雪瑩1, 2, 3, 4, 王廣策2, 3, 4, 張寶玉2, 3, 4, 宮相忠1

(1. 中國海洋大學 海洋生命學院, 山東 青島 266003; 2. 中國科學院海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266237; 4. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071)

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PYC)在非光合生物中催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸(oxaloacetate, OAA), 作為糖異生的第一步, 在動物維持代謝穩態中具有重要作用。研究發現, PYC在光合生物中也發揮重要作用。為了探究PYC在潮間帶大型海藻中的作用, 我們從條斑紫菜葉狀體中擴增獲得基因全長序列(命名為), 并分析了其序列特征。通過對系統進化樹分析表明PyPYC與來自細菌的PYC具有較近親緣關系。針對條斑紫菜葉狀體生長環境所面臨的碳源變化, 設置了不同類型和不同濃度的無機碳培養條件, 采用實時熒光定量(RT-qPCR)檢測了該基因對這些無機碳源的響應。結果表明, 高濃度的CO2能顯著上調基因的表達, 而高濃度的HCO3?對其影響較小。由此, 我們初步認為, 當紫菜葉狀體暴露在空氣中時, PYC在其無機碳利用中發揮一定作用。

丙酮酸羧化酶; 條斑紫菜; 無機碳利用

條斑紫菜()是屬于原紅藻綱 (Protoflorideae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紫菜屬()的一種大型海藻, 是東南亞地區重要的經濟海藻之一。它的生活史是由絲狀孢子體和葉狀配子體組成, 屬于異型世代交替[1-2]。紫菜營養豐富, 富含氨基酸、蛋白質、不飽和脂肪酸及多種微量元素, 是低脂肪高蛋白的健康綠色食品; 因其含有豐富的多糖尤其是瓊膠, 也使其成為重要的化工原料; 紫菜除了經濟價值和營養價值外, 其葉狀體在生長過程中可大量吸收 C、N、P等, 是海洋生態系統中重要的碳庫、氮庫和磷庫[3]。紫菜作為潮間帶海藻, 野生型葉狀體隨潮汐變化會經歷暴露在空氣中數小時和沒入水中的生境變化, 在規模化養殖過程中, 漁民也需要定期將紫菜苗簾暴露在空氣中以去除雜藻及提高品質[4]。為更深入了解紫菜, 國內外學者對紫菜的生活史、影響生長因素、抗逆和代謝產物等方面開展了大量的研究, 使之逐漸成為研究紅藻的代表性物種[5-7]。

丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase, PYC)最早在雞的肝臟線粒體中發現[8], 后來在非光合生物真菌線粒體中也發現了PYC。它屬于生物素酶家族, 其特征是具有共價連接的生物素作為輔助因子, 依賴ATP, 催化丙酮酸和HCO3?生成草酰乙酸(oxaloacetate, OAA), 該反應作為糖異生的第一步, 在動物維持代謝穩態中具有重要作用[9]。如哺乳動物中PYC的缺失會引發神經系統紊亂, 代謝性酸中毒或癌癥等多種代謝疾病[10-11]。缺乏基因的釀酒酵母()突變體在葡萄糖作為唯一碳源時, 不能存活[12-13]。1990年, 研究者在胡蘿卜、玉米、向日葵和油菜的細胞提取液發現了PYC活性, 首次證明了植物中PYC的存在, 但尚未明確其在植物不同部位或發育過程中的功能[14]。隨著研究技術的發展和水平的提高, PYC陸續被發現存在微藻中[15-16]。Tsuji等[17]證實丙酮酸羧化酶存在海洋單細胞藻質體中,m(米氏常數: 酶促反應達到最大反應速度一半時對應的底物濃度)值顯示該質體丙酮酸羧化酶對丙酮酸有較高的親和性, 主動參與羧化用于回補OAA, 作者推測PYC或許在各種水生光合生物中起著不可或缺的作用。當綠藻C-169培養在2% CO2環境時, PYC的RNA水平和酶活均增加, 作者認為PYC參與CO2固定進而提高無機碳利用率[16]。綜上所述, PYC似乎在促進水生光合生物無機碳利用方面發揮一定的作用, 到目前為止我們對此還是了解較少。我們前期在分析條斑紫菜葉狀體和絲狀體對不同無機碳響應的轉錄組數據(該轉錄組數據見國家基因庫https://db. cngb.org/cnsa/, 序列入口為CNP0000880)時, 發現有類似于PYC 的unigene序列, TRINITY_DN105351_ c0_g1和TRINITY_DN15039_c0_g1, 但對該基因及相應蛋白的特點, 以及在紫菜中發揮的功能知之甚少, 因此本文對條斑紫菜丙酮酸羧化酶展開詳細研究。

以條斑紫菜葉狀體cDNA為模板擴增獲得基因全長編碼區序列后, 與來自其他物種的丙酮酸羧化酶核酸及蛋白序列進行比對分析, 明確序列特征。同時用加富CO2的空氣或改變人工海水中NaHCO3濃度方式設置不同無機碳源條件培養紫菜葉狀體, 探究基因在條斑紫菜葉狀體無機碳利用中的響應。

1 材料與方法

1.1 材料

條斑紫菜葉狀體來自中國科學院海洋研究所藻類種質庫, 在含有PES營養鹽的無菌海水中培養。培養條件為: 溫度15～18 ℃, 光照強度15～30 μmol·m?2·s?1, 光暗周期為14 h∶10 h, 每周更換1次培養基。

1.2 方法

1.2.1 條斑紫菜不同碳源處理

選取葉片大小相近且生長旺盛的健康藻體為材料, 分別置于含不同濃度NaHCO3人工海水培養, NaHCO3終濃度分別為2、4、8 mmol/L。NaHCO3濃度設置基于在15 ℃, pH 8.07時, 自然海水中可溶性無機碳濃度為2.1 mmol/L, 而可溶性無機碳的主要成分是HCO3?, 占91%[18]。每150 mL人工海水培養0.03 g新鮮藻體, 其余培養條件同上。參考文獻[19-20]室內培養紫菜方法, 每2 d全部更換培養基的培養條件, 我們將培養在不同NaHCO3濃度的葉狀體培養24 h后, 光照時采收。

在以CO2為碳源的處理中, 我們將條斑紫菜葉狀體平鋪于細胞培養瓶中的濾紙上并一直保持濕潤, 分別往培養瓶中通入正常空氣(CO2體積分數為4.17×10–4)和加富CO2的空氣(CO2終體積分數分別為1×10–3和2×10–3)。青島附近海域的半日潮使得野外生長的條斑紫菜干出時間約為2～4 h, 因此我們將條斑紫菜葉狀體處理3 h后采收, 吸干表面水分后用液氮凍存, 以備后續使用。在處理過程中始終保持不低于60%的含水量, 光照強度30 μmol·m?2·s?1, 溫度15～18 ℃。以上實驗設計每組處理設置3個平行。

1.2.2 RNA提取及反轉錄制備cDNA

條斑紫菜葉狀體RNA提取及反轉錄方法參考文獻[21]。簡介如下: 約100 mg新鮮培養的葉狀體用吸水紙吸掉表面的水分, 迅速用液氮冷凍研磨, 然后用植物RNA提取試劑盒(天根, 北京)提取。提取的RNA首先用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗其質量, 然后用Nanodrop Photometer分光光度計(德國)測定RNA的純度與濃度。

用于擴增目的基因的cDNA采用MMLV試劑盒(promega)反轉, 反轉過程未去除基因組DNA。用于實時熒光定量PCR(RT-qPCR)的cDNA依據Takara反轉錄酶試劑盒說明書 (TaKaRa, 大連)進行, 具體實驗操作步驟如下: 1) 去除基因組DNA反應。5′gDNA Eraser Buffer 2mL, gDNA Eraser 1mL, Total RNA (1 000 ng), 添加RNase Free dH2O至10mL; 42℃ 2 min; 2) 反轉錄反應。向步驟1的反應液中加入以下試劑, PrimeScript RT Enzyme Mix I 1mL, RT Primer Mix 1mL, 5′Primescript Buffer 4mL, RNase Free dH2O 4mL; 37 ℃ 30 min, 85 ℃ 5 s, 4 ℃保存。所獲cDNA模板置于?20 ℃暫存。

1.2.3 目的基因擴增

分析轉錄組unigene TRINITY_DN105351_c0_g和TRINITY_DN15039_c0_g1序列后, 利用Primer Premier 5.0設計用于擴增目的基因的引物, 引物名稱及序列見表1。采用Touchdown程序, 即: 94 ℃2 min, 98 ℃30 s, 接下來10循環98 ℃30 s, 65 ℃15 s, 68 ℃150 s, 每個循環退火溫度降低0.1 ℃, 接下來進入30個循環為98 ℃30 s, 55 ℃15 s, 68 ℃150 s, DNA聚合酶為Tks Gflex (TaKaRa, 大連), 所用儀器為SensoQuest Labcycler (SensoQuest, 德國)。

表1 本文所用引物序列

1.2.4 序列分析及系統進化樹構建

所獲得的序列在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast)上用BLASTx進行比對。跨膜結構預測采用TMpred軟件[22], 信號肽預測采用SignalP 5.0版(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。多序列比對采用ClustalＸ程序[23]。采用MEGA 10.0軟件[24]和最大似然法(maximum likelihood, ML)構建系統進化樹, 重復次數為1 000次, 建樹所用的最佳模型為WAG+ G+I模式。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

用于RT-qPCR的引物名稱及序列見表１, 并在圖1B中用雙下劃線標出。以GAPDH為內參基因[25]。反應所用試劑購自Roche公司(Switzerland), 儀器為Quant Studio1 (Thermo Fisher Scientific Inc., U. S.)。PCR反應條件為: 94 ℃2 min, 接下來40循環為94 ℃15 s, 60 ℃15 s, 72 ℃20 s, 擴增結束后的溶解曲線分析為檢測擴增產物特異性。RT-qPCR數據采用相對定量法分析, 用SPSS單因素方差分析檢驗顯著性差異水平。

2 結果與分析

2.1 PyPYC基因核酸全長序列的獲得

引物對PyPYC1-F/PyPYC1-R和PyPYC2-F/ PyPYC2-R分別對應TRINITY_DN15039_c0_g1和TRINITY_DN105351_c0_g1序列。盡管在模板濃度、退火溫度以及Taq酶等方面都做了很多嘗試, 用PyPYC1-F/PyPYC1-R引物無法獲得PCR產物, 也就是說不能獲得RINITY_DN15039_c0_g1對應序列。而且, 該unigene序列在條斑紫菜基因組序列[7](BioProject PRJNA589917 in NCBI)中也無匹配序列。因此, 我們初步認為來自轉錄組的TRINITY_ DN15039_c0_g1為來自細菌污染。采用引物對PyPYC2-F和PyPYC2-R獲得大約4 K的PCR產物(圖1a)。測序后共獲得3 546 bp的核酸序列, 除去324 bp的內含子區外, 其余部分與TRINITY_ DN105351_c0_g1相同(圖1b)。該序列對應條斑紫菜基因組第一條染色體上從14 819 602至14 823 147區域的核酸序列。經BlastX比對發現, 該序列與來自紅藻PYC1氨基酸序列(序列入口號: KAA8491876.1)有61%的相似性, 與細菌的PYC氨基酸序列(RZO64306.1)有53%的相似性, 從而確定該產物為條斑紫菜的基因, 命名為。

2.2 序列特征分析及系統進化樹分析

丙酮酸羧化酶催化丙酮酸和HCO3?結合生成草酰乙酸的整個反應分為以下兩步進行[26-28]:

(1)

(2)

在結構上, 典型的丙酮酸羧化酶由4個相同的亞基排列成四面體狀結構, 每個亞基包含3個功能結構域: 生物素羧化(BC, biotin carboxylase)結構域、轉羧基(CT, carboxyltransferase) 結構域以及生物素羧基載體(BCCP, biotin carboxyl carrier protein)結構域[27, 29]。這種依賴生物素的羧化酶在2個活性位點以2個連續的步驟執行它們的活性, 在第一步反應中, 可移動的羧基載體生物素在BC活性部位進行羧化, 這一過程需要Mg-ATP提供能量。然后, 結合了羧基的生物素被BCCP轉移到CT活性中心將羧基轉移到底物丙酮酸上, 使丙酮酸完成羧化反應[30]。并且, PYC的每個亞基都含有一個緊密結合的二價金屬離子(Zn2+/Mg2+), 它作為PYC的輔助因子似乎起著結構性的作用[27]。

圖1 采用PyPYC2-F和PyPYC2-R引物擴增PyPYC基因及其核苷酸序列和對應的氨基酸序列

Fig. 1 Electrophoresis pattern of the DNA fragments amplified with the PyPYC2-F and PyPYC2-R primer pairs, nucleotide sequence of PyPYC and its relative putative amino acids

注: 圖1b中黑色加粗處為內含子區域, 單下劃線為擴增基因全長序列所用引物區, 雙下劃線為熒光定量檢測所用引物區。

我們采用ClustalX軟件將不同來源的PYC氨基酸序列進行比對和相似性分析(表2和圖2), 發現來自不同物種的PYC氨基酸序列具有較高的保守性, PyPYC與來自C-169、和Ch24-10的PYC分別有41.2%, 42.6%和38.3%相似性(表2)。在這些物種PYC序列上已經證實的活性位點區域, 如與Mg-ATP結合的位點(ERNCSIQRRHQKV 和 QVEH), BCCP結構域中的生物素結合位點(AMKM), CT結構域中丙酮酸結合位點(ETWGGATFDVAM RFLECPWERL)和1個二價金屬離子(Zn2+/Mg2+)結合位點(HVHTH)等[31], 在PyPYC序列中也同樣存在, 且序列相似度較高(圖2)。

表2 氨基酸序列相似性

注: Cs代表C-169; Sc代表; Rp代表Ch24-10

圖2 來自不同物種的PYC氨基酸序列比對

注: 登錄號分別為:C-169 (XP_005642706.1)、(CAA42544.1)、Ch24-10 (KKZ88730.1)

在系統進化樹上(圖3), PyPYC與來自紫球藻()PYC以100%的bootstrap值聚在一起, 然后該分支又以較高的bootstrap值(72%)與來自絲囊霉菌()和假微型海鏈藻(CCMP1335)的PYC組成一個分支。此外, 在進化關系上, 該分支又和來自太平洋鄰囊菌()和細菌()的PYC聚為一支。這些結果似乎表明, PyPYC與細菌的PYC有較近的親緣關系。

圖3 由PYC氨基酸序列構建的系統發育樹

注: 登錄號分別為:(KAA8491876.1)、(XP 008865358.1)、CCMP1335 (EED88205.1)、(WP 045116520.1)、(RZO64306.1)、(QDZ22274.1)、(XP_002503347.1)、(PNH00295.1)、C-169 (XP_ 005642706.1)、(PSC70059.1)、S288C (NP 011453.1)、(WP 003505139.1)、(WP 011013816.1)

2.3 PyPYC基因對不同類型和不同濃度碳源的響應

為探究基因對不同碳源的響應情況, 我們采用實時熒光定量PCR檢測了在不同處理中的表達量變化(圖4)。結果顯示, 在以NaHCO3作碳源時,基因的表達量隨NaHCO3濃度升高出現上調趨勢, 但和正常濃度碳(2 mmol/L NaHCO3)相比, 差異不顯著(圖4a); 而在以CO2為碳源加富處理時,基因表達量隨著CO2濃度的升高顯著升高, 特別是暴露在體積分數為2×10–3CO2時, 其表達量比暴露在空氣高14倍(圖4b)。

圖4 PyPYC基因表達對不同碳源的響應

3 討論

如圖2所示, 來自條斑紫菜的PYC蛋白序列活性位點與來自細菌(,)和微藻(C-169)PYC的對應位點序列幾乎完全相同, 該結果說明PYC氨基酸序列功能性位點區域在進化上非常保守。

如前所述, 條斑紫菜葉狀體在生長過程中由于生境的變化而經歷不同類型碳源(暴露在空氣中接觸空氣CO2及沒入海水接觸海水無機碳)和含水量的變化。前期研究表明, 紫菜葉狀體在含水量不低于60%時, 增加空氣中CO2能提高紫菜100% CO2固定率[4, 32-33]。因此, 在獲得條斑紫菜基因全長序列后, 在保證其含水量不受脅迫(含水量>60%)的前提條件下(將紫菜葉狀體置于濕潤的濾紙上, 見方法部分), 我們模擬葉狀體在野外生境的碳源情況, 探究紫菜葉狀體中羧化酶基因對不同碳源的響應。結果表明, 相對于碳酸氫根作為主要碳源, 葉狀體中的基因對CO2的變化更敏感(圖4)。自20世紀70年代以來, 越來越多的證據表明, 大多數藻類存在CO2濃縮機制(CO2concentrating mechanism, CCM), 該機制協助藻類高效利用海水和空氣中的無機碳源[32, 34-38]。而且, 有些海藻的CCM機制中不僅存在碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA), 還發現類似高等植物高效固碳途徑-C4途徑的一些酶, 如烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate Carboxylase, PEPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxy-kinase, PEPCK)等, 某些特殊生境或培養條件會誘導類C4途徑酶發揮固碳作用[39-42]。如在大型綠藻滸苔()中發現, 低光和低CO2水平時主要通過CA利用海水中的HCO3?, 而高光(1 200～2 000 μmol photons·m–2·s–1)時, 則通過PEPC和PEPCK酶利用HCO3?, 從而揭示了滸苔高效固碳機制[43]。

與滸苔不同的是, 條斑紫菜葉狀體中PEPC酶活較低, 并且在加富HCO3?(4 mmol/L)人工海水培養時,和轉錄水平表達出現升高趨勢, 同時也伴隨著 PYC羧化酶活和PEPCK脫羧酶活的升高[37]。Shao等[44]研究同樣表明, 高碳(0.1 mol/L KHCO3)促進海帶()PEPCK脫羧酶活性增加, 但未檢測到PEPC酶活。以上結果表明, 大型紅藻和褐藻中可能存在與大型綠藻不同的類C4途徑, 綠藻以PEPC和PEPCK途徑為主, 而紅藻和褐藻以PYC和PEPCK為主。萊茵衣藻()在低碳條件培養(培養基通入空氣, 即含體積分數為3.60×10–4CO2), 增加培養基中NH4+后, PYC酶活比PEPC酶活升高, 作者認為該結果證實了以前的研究結論, 即植物細胞內不同的羧化酶提供了OAA合成支路, 為三羧酸循環提供C4復合物, 從而為氮同化和氨基酸合成提供碳骨架[45]。

綜上所述, 我們初步認為, 適當高濃度無機碳環境(如增加空氣中CO2和增加水體中HCO3?), 能誘導條斑紫菜和表達進而協助紫菜進行高效固碳, 而且高濃度CO2更易于誘導的表達。基因對高濃度CO2的響應將有助于條斑紫菜葉狀體暴露在空氣中時高效利用大氣中CO2, 至于基因對CO2和HCO3–表現出不同的響應則需要更深入的研究。

4 總結

來自不同物種(細菌, 古細菌, 微藻及大型海藻) PYC在活性位點區的氨基酸序列比較保守, 而且來自條斑紫菜、紫球藻和假微型海鏈藻的PYC與細菌的PYC有比較近的親緣關系。該基因在RNA水平上對環境中CO2的變化響應比對HCO3–更敏感, 推測其在協助條斑紫菜高效利用空氣中CO2發揮作用。

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Expression of the pyruvate carboxylase gene inin response to different inorganic carbon sources

LIU Xue-ying1, 2, 3, 4, ZHANG Bao-yu2, 3, 4, WANG Guang-ce2, 3, 4, GONG Xiang-zhong1

(1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Pyruvate carboxylase (PYC) catalyzes the carboxylation of pyruvate to oxaloacetate in non-photosynthetic organisms. PYC plays an important role in maintaining metabolic homeostasis in animals as the first step in gluconeogenesis. PYC also functions in photosynthetic organisms, including microalgae and plants, but its function in macroalgae inhabiting the intertidal zone is unknown. In this study, the complete sequence of thegene (namely) was obtained from the thallus cDNA ofand the sequence characteristics were analyzed. The phylogenetic tree based on amino acid sequences indicated that PyPYC was closely related to PYC from prokaryotes. Different types and concentrations of inorganic carbon sources were employed during the cultivation of the thallus based on the changes in carbon sources that wild thallus ofencounter in the natural intertidal zone. The relative expression level ofin thallus cultivated under these inorganic carbon conditions was evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction. The results demonstrated that the transcription ofwas significantly induced by a high concentration of CO2compared with the normal inorganic carbon concentration. The change in transcription was not as obvious in response to a high concentration of HCO3–. Therefore, we propose that PYC probably plays a particular role in inorganic carbon utilization whenthallus is exposed to the atmosphere.

Pyruvate carboxylase;; inorganic carbon utilization

Apr. 22, 2022

Q71

A

1000-3096(2022)12-0138-10

10.11759/hykx20220422001

2022-04-22;

2022-07-14

國家自然科學基金(41876163); 中國科學院海洋大科學研究中心重點部署項目(COMS2019Q02); 山東省“泰山學者”工程專項經費資助項目(tspd20210316); 財政部和農業農村部: 國家現代化農業產業技術體系(CARS-50)

[National Natural Science Foundation of China, No.41876163; The Key Deployment Project of the Centre for Ocean Mega-Research of Science, the Chinese Academy of Sciences, No. COMS2019Q02; Taishan Scholar Project of Shandong Province, No. tspd20210316; Ministry of Finance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs: National Modern Agricultural Industry Technology System Project, No. CARS-50]

劉雪瑩(1998—), 女, 山東泰安人, 碩士研究生, 主要從事藻類分子生物學與發育調控研究, E-mail: liuxueying@stu.ouc.edu.cn; 張寶玉(1975—),通信作者, 副研究員, 主要從事藻類分子生物學和發育調控, E-mail: byzhang@qdio.ac.cn; 宮相忠(1963—), 通信作者, 教授, 主要從事海藻繁殖生物學研究, E-mail: gxzhw@ouc.edu.cn

(本文編輯: 趙衛紅)