波形蛋白表達與聯合檢測血清CA19-9在肝門部膽管癌的臨床意義

王 石,夏醫君,胡志偉,王 磊,佟根喜,王 鵬*

(1.內蒙古自治區人民醫院 肝膽胰脾外科，內蒙古 呼和浩特010010;2.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特010010)

被稱為Klatskin瘤(Klatskin tumor)的肝門部膽管癌(Hilar cholangiocarcinoma，HCCA)，在膽道系統中是最為常見的一種惡性腫瘤，主要發生的部位是左肝管、右肝管、左右肝管分叉部以及肝總管位置[1]。此腫瘤在膽管黏膜下層沿膽管壁縱向生長，透壁性浸潤并向膽管周圍的其它組織呈放射狀擴散，同時伴有對神經的侵犯以及淋巴結的轉移[2]。波形蛋白(Vimentin，VIM)作為Ⅲ型中間絲纖維蛋白，它的變化能夠使多數腫瘤細胞骨架和細胞外基質發生重排、重塑，從而獲得間質細胞特征,使得細胞形態發生改變，獲得侵襲轉移能力，細胞侵襲性增強[3]。糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是臨床上較為實用的一種腫瘤標志物，CA19-9的檢測對某些腫瘤的診斷以及腫瘤組織的大小及分期的預測具有一定的臨床意義[4]。本實驗通過免疫組織化學染色方法檢測波形蛋白在肝門部膽管癌的表達及分析血中CA19-9水平在肝門部膽管癌的臨床意義。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗對象

VIM的實驗對象：實驗組為收集2010年12月-2020年12月期間因“HCCA疾病”于內蒙古自治區人民醫院肝膽外科住院行根治性手術切除的存檔組織蠟塊60例，對照組為癌旁組織60例(經病理科專家鏡下確定為無癌細胞的膽管組織)；所有標本均經病理科專家顯微鏡下確診，出具報告單，標本4%甲醛固定，石蠟包埋，編號存檔。實驗組取標本入組時的標準：①經手術切除的組織經病理確診為HCCA；②術中均留取HCCA組織作為標本；③有完整臨床及隨訪資料；④術前均未接受化療或放射治療；⑤年齡性別不限。排除標準：①圍術期死亡者；②臨床資料不完整者；③合并有嚴重的心肝腎肺疾病以及精神疾病者；④合并其他惡性腫瘤者；對照組取標本時納入標準：①標本經病理科專家鏡下確定為無癌細胞的膽管組織；②有完整臨床及隨訪資料；③術前均未接受化療或放射治療；④年齡性別不限。排除標準：①圍術期死亡者；②臨床資料不完整者；③合并有嚴重的心肝腎肺疾病以及精神疾病者；④合并其他惡性腫瘤者；

CA19-9的實驗對象：實驗組同上(按條件選擇的60例HCCA患者)；對照組為按條件選擇的60例膽總管結石患者；其中60例膽總管結石患者的入組標準是：①有完整的臨床病理資料；②患者經手術或臨床確診為膽管良性疾??；③無其他系統惡性腫瘤或是良性疾病。排除標準為：①圍術期死亡者；②臨床資料不完整者；③合并有嚴重的心肝腎肺疾病以及精神疾病者；④合并其他惡性腫瘤者。

1.2 實驗方法

通過免疫組化方法分別檢測60例肝門部膽管癌癌組織及癌旁組織中波形蛋白的表達，并分別收集實驗組及對照組各個患者入院術前的血清CA19-9數值(單位為U/mL)，做好記錄。

1.3 IHC結果的判定

免疫組織化學結果分析：在醫學光學顯微鏡下進行評分，以細胞質內出現淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為VIM陽性細胞，按視野中陽性細胞染色比例進行評分，再按染色程度進行評分。根據細胞染色強度進行評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按染色比例進行評分：未著色為0分，1%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，76%-100%為4分。染色強度與染色比例的乘積為最終評分，最終評分<3分為低表達，≥3分為高表達。

血清CA19-9水平分析：CA19-9≥39 U/mL 為陽性(高水平)，CA19-9<39 U/mL 為陰性(低水平)。

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件分析相關數據，計量資料采用χ2檢驗，相關性分析采用SPEARMAN秩相關進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在HCCA癌組織及癌旁組織中VIM表達的情況

在本實驗中：(1)實驗組(即HCCA患者癌組織)中VIM呈高表達者：43例患者；(2)對照組(即HCCA患者癌旁膽管組織)中VIM呈高表達者：23例患者；VIM在HCCA癌組織及癌旁組織中的高表達率分別為71.7%和38.3%，表達程度的差異性顯著，具有統計學意義(P=0.001<0.05)，見圖1。

圖1 鏡下：在HCCA組織中VIM的高表達為A圖(×200倍，×400倍)，低表達為B圖(×200倍，×400倍)；在癌旁正常膽管組織中VIM的高表達為C圖(×200倍，×400倍)，低表達為D圖(×200倍，×400倍)。

2.2 HCCA患者中VIM表達的程度與各臨床病理參數的關系

在本實驗中，通過60例癌組織切片檢測VIM表達程度與各臨床病理參數的相關性分析如下：

(1) 年齡≥60歲的患者癌組織中波形蛋白的陽性表達率高于<60歲的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=19.86，P<0.05)，有統計學意義；腫瘤直徑≥2 cm的波形蛋白表達率高于腫瘤直徑<2 cm的患者，具有顯著的差異性(χ2=20.86，P<0.05)，在統計學中有意義；低分化患者的癌組織中波形蛋白的陽性表達率顯著高于中、高分化患者(χ2=10.86，P<0.05)，差異有統計學意義；在淋巴轉移為陽性的患者中波形蛋白的陽性表達率高于淋巴轉移陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=17.93，P<0.05)，在統計學中有意義；在腫瘤TNM分期中的T分期里：在T3/T4期中波形蛋白的陽性表達率高于T1/T2期，兩組有顯著的差異性(χ2=18.61，P<0.05)，在統計學中有意義；血管侵犯為陽性的患者中VIM的陽性表達率高于血管侵犯為陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=7.07，P<0.05)，在統計學中有意義。

(2)其中HCCA中的VIM表達程度與患者性別、神經侵犯的相關性均無顯著的統計學差異(χ2=3.10、1.05，P>0.05)。

2.3 HCCA患者及所患良性膽管疾病(膽總管結石)患者血清中的術前CA19-9水平

在本實驗中：(1)實驗組(即HCCA患者)中術前的血清CA19-9水平明顯為高(陽性)：40例患者；(2)對照組(即：膽總管結石患者)術前的血清CA19-9水平明顯為高(陽性)：25例患者；CA19-9在HCCA患者及膽總管結石患者中的陽性率分別為66.7%和41.7%，其水平高低程度有明顯的差異，此差異具有統計學意義(P=0.006<0.05)。

2.4 HCCA患者血清CA19-9水平程度與臨床病理參數的關系

本實驗通過收集60例HCCA患者相關數據，研究HCCA患者術前血清中CA19-9水平與各組臨床病理參數之間的相關性：

(1)年齡≥60歲的HCCA患者中CA19-9水平的陽性率高于<60歲的患者，兩組的差異性明顯(χ2=6.34，P<0.05)，具有統計學意義；腫瘤直徑≥2 cm患者的CA19-9水平的陽性率高于腫瘤直徑<2 cm的患者，具有顯著的差異性(χ2=32.175，P<0.05)，在統計學中有意義；低分化患者的CA19-9水平的陽性率高于中、高分化患者，差異性顯著(χ2=19.86，P<0.05)，有統計學意義；在淋巴轉移為陽性的患者中CA19-9水平的陽性率高于淋巴轉移陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=16.15，P<0.05)，有統計學意義；在腫瘤TNM分期中的T分期里：在T3/T4期中CA19-9水平的陽性率高于T1/T2期，兩組有顯著的差異性(χ2=35.71，P<0.05)，有統計學意義；血管侵犯為陽性的患者中CA19-9水平的陽性率高于血管侵犯為陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=25.65，P<0.05)，有統計學意義；神經侵犯陽性的患者中CA19-9的陽性率高于神經侵犯陰性的患者，兩組有顯著的差異性(χ2=6.54，P<0.05)，在統計學中有意義。

(2)術前CA19-9水平與患者性別的相關聯性沒有統計學差異(χ2=0.54，P>0.05)。

2.5 HCCA患者中VIM表達和血清中CA19-9水平的關聯性

對60例HCCA患者中VIM和CA19-9的關聯性進行分析，結果顯示：在HCCA患者，VIM的高表達與血清CA19-9高水平(陽性)成正相關，具有統計學意義，(相關系數r=0.34，P=0.008)，提示VIM的表達與術前血清中CA19-9的水平呈現協同作用。

2.6 預后分析(生存分析)

2.6.1單因素分析 (1)使用Kaplane-Meier法進行分析后顯示，HCCA患者中VIM的高表達和術前血清中CA19-9的高水平(陽性)與患者的預后不良明顯相關(Log Rank=14.350,P=0．000；Log Rank=32.592,P=0．000)，在統計學中有意義。

(2)此外，年齡≥60歲、腫瘤大小≥2 cm，腫瘤低分化、淋巴轉移陽性、腫瘤TNM分期中的T分期為T3/T4、血管侵犯陽性等因素與患者預后差相關(Log Rank=4.898，P=0.027；Log Rank=19.833,P=0.000；Log Rank=10.705，P=0．001；Log Rank=21.822，P=0．000；Log Rank=28.742，P=0．000；Log Rank=25.516，P=0.000)，同時具有統計學意義。

(3)預后情況與患者的性別、神經侵犯不相關(Log Rank=0.160,P=0．689；Log Rank=3.212,P=0．073)，無統計學意義。

2.6.2多因素分析 將影響HCCA患者預后的單因素變量(P<0.05)納入COX多因素分析證實：影響HCCA患者根治性切除術后生存時間的獨立危險因素為VIM高表達、CA19-9陽性、淋巴轉移陽性、血管侵犯陽性，具有統計學意義，見表1。

表1 影響實驗組對象(60例HCCA患者)預后的多因素分析

3 討論

HCCA是一種最難治療的腫瘤之一，具有侵襲性腫瘤生物學特性，手術切除目前是治療的理想方法，但是由于腫瘤大小、淋巴轉移、血管及神經侵犯等病理因素的影響，多數患者手術切除率低，復發率高，生存期短[5]。因此對HCCA的早期診斷在患者后期進一步的治療中具有重要意義。多種腫瘤標記物(如血清糖類抗原19-9、糖類抗原125和癌胚抗原等)的聯合檢測可有效的預測HCCA，但由于血清學的檢測易受多種因素的影響，在臨床應用中相對受限；對于這種難治療的腫瘤，我們應不斷通過科研來提高其診斷及治療方式，改善預后，為患者帶來福音。目前，由于腫瘤診斷過程的煩瑣、費用昂貴等因素致使HCCA的早期診斷無法順利進展。因此,在人體體液內檢測腫瘤細胞分泌的靶基因可能作為一種無創的、高度可靠的診斷方式出現在臨床中。

波形蛋白(Vimentin，VIM)是上皮向間充質過渡(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)的標志，在促進腫瘤細胞的發展、遷移、侵襲過程中起著重要的作用。有研究表明，間充質特征與疾病復發、轉移、腫瘤進展和預后惡化的傾向顯著相關，而VIM正是一種在間充質細胞(如成纖維細胞、巨噬細胞、內皮細胞)中組成性表達的Ⅲ型中間絲蛋白。VIM的高表達影響著晚期腫瘤分期及預后，VIM在多種惡性腫瘤(如乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、結直腸癌和卵巢癌)的癌組織中都呈現高表達狀態[6]。本次實驗中，通過免疫組化方法檢測結果分析，發現VIM在HCCA癌組織中表達程度明顯高于癌旁組織，對比差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)；并且通過分析VIM與HCCA患者的多種臨床病理因素的關系，得知VIM的高表達與HCCA患者的年齡≥60歲、腫瘤大小≥2 cm明顯相關，同時與腫瘤低分化、淋巴轉移陽性、腫瘤TNM分期中的T分期(T3/T4)、血管侵犯陽性等因素也相關聯，在統計學中均有意義(P<0.05)；與患者的性別、神經侵犯并無明顯相關性，也無統計學意義(P>0.05)。本實驗結果充分表明，VIM在HCCA的發生和發展中起著極大的作用。研究發現EMT是細胞獲得逃逸能力的過程，是從上皮層侵入間質并形成轉移灶的過程，VIM作為其標志性分子，與多種腫瘤的預后有著密切的關系[7]。本實驗結果也表明，在HCCA患者中，VIM表達高的患者比表達低的患者的生存時間明顯要短，再次證實了VIM對HCCA患者的預后不良起著重要的作用。從而進一步推測VIM將來可以作為一種生物標記物，被用來評估和預測患者術前和術后生存情況。

糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是在臨床上應用價值很大的一種腫瘤標志物，應用于多種惡性腫瘤患者的檢測[8]。其在膽管癌的診斷和預后檢測中的作用被大家一致認可。已有研究表明術前 CA19-9 高水平是膽管癌患者預后不良的獨立因素，在膽管癌的診斷中，其靈敏性也較高[9-10]。本實驗中，通過收集實驗組與對照組二組中受檢對象的血清CA19-9數值，進行統計結果分析，發現CA19-9在HCCA患者中的水平明顯高于良性膽管疾病(膽總管結石)患者，對比差異顯著，具有統計學意義(P<0.05)；并且通過分析可知：CA19-9的高水平(陽性)與HCCA患者的多種臨床病理因素(即年齡≥60歲、腫瘤大小≥2 cm、腫瘤低分化、淋巴轉移陽性、腫瘤TNM分期中的T分期(T3/T4)、血管侵犯陽性及神經侵犯陽性)明顯相關聯，有統計學意義(P<0.05)；而與性別無明顯相關，無統計學意義(P>0.05)。本實驗結果表明，在HCCA中，血清中CA19-9水平高(陽性)的患者比水平相對低(陰性)的患者的生存時間短，這證實了在HCCA患者的預后中，術前血清CA19-9高水平作為一個相對獨立的危險因素影響著HCCA患者的預后。在將來，血清CA19-9可能會被用于對早期HCCA的監測以及評估和預測患者術前和術后生存情況。

本實驗研究在HCCA患者中VIM表達與血清中CA19-9水平情況的相關性進行分析后得知，VIM表達與血清中CA19-9的水平存在明顯的正相關性，這表明在HCCA的發生、發展過程中，VIM與CA19-9起著協同作用。實驗結果顯示，在HCCA患者中高表達的VIM和高水平的CA19-9與患者的臨床病理因素(如年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴轉移、腫瘤TNM分期中的T分期、血管侵犯等)相關。同時也證實了VIM高表達、CA19-9高水平、淋巴轉移陽性、血管侵犯陽性等可作為獨立危險因素影響HCCA患者的預后。

在HCCA患者中，我相信通過不斷對VIM及血清中CA19-9的研究，VIM與CA19-9的聯合檢測將來可為HCCA患者的早期診斷提供一個可靠的依據，同時也可為該疾病的靶向治療領域提供一個新的治療手段。

作者簡介：王石，內蒙古自治區人民醫院肝膽胰脾外科主任醫師，碩士研究生導師;王鵬，內蒙古自治區人民醫院，肝膽胰脾外科醫師。