大球蓋菇菌渣對鹽堿土區林地土壤的改良研究

齊廣耀 張書菡 孫建平 劉雅輝 蘇斌 呂騏羽 姜淑霞

摘要：為研究大球蓋菇出菇后剩余栽培基質（菌渣）就地還田對濱海鹽堿土區林地土壤的改良效果，選用3種不同含鹽量的林地栽培大球蓋菇，將出菇后的菌渣就地混翻于0～20cm土層中，自然降解4個月后，研究其對試驗林地土壤理化性質、養分含量及土壤真菌群落結構的影響。結果表明：3種濱海鹽堿土區林地土壤的EC值、含鹽量及容重均顯著降低;土壤孔隙度、水穩性團聚體、有機質、速效磷、堿解氮含量均顯著提高;3個處理樣地真菌群落的Beta多樣性變化明顯，強度鹽化處理樣地（Z2s）土壤真菌群落的Alpha多樣性顯著提高。環境因子關聯分析表明，濱海鹽堿土區林地理化性質與土壤真菌群落分布顯著相關。綜之，施入大球蓋菇菌渣能有效降低濱海鹽堿土區林地的土壤含鹽量，優化土壤理化性質，改善土壤真菌群落結構，改良效果顯著。

關鍵詞：大球蓋菇菌渣;鹽堿土改良;土壤理化性質;土壤真菌群落

中圖分類號：S156.4+2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2022）01-0104-07

我國濱海鹽堿土總面積達500萬hm2，多年來主要采取一些物理措施，如整土、覆蓋、深耕、添加磷石膏、沸石粉及井溝渠灌等來改變鹽堿地的土壤結構，降低其含鹽量[1]，這些措施達到一定的改良效果。但物理措施和水利工程方法需較大的工程量和較高的投資成本，化學手段存在二次污染等問題。食用菌出菇后剩余的栽培基質又稱為菌渣，具有容重小、通氣性好的特性，富含大量纖維素、菌絲蛋白等有機質和多種微生物及酶等其他活性物質[2，3]。國內外的研究發現菌渣對改良土壤理化性狀、增加土壤養分含量、改良土壤微生物群落結構、促進植物營養吸收都有著積極作用[4-7]。

大球蓋菇（Strophariarugosoannulata）是近年來我國新興起栽培的一種珍稀食用菌品種，可在田間、林下、大棚等地進行栽培。其栽培模式主要以各種農林廢棄物為原料，通過堆積發酵、鋪料、播種進行栽培生產，"菇后殘余的大量栽培基質（菌渣）可以就地還田，有改良土壤的作用。本實驗室前期研究表明大球蓋菇在林地栽培出菇后，菌渣就地還田對林地土壤有較好的土壤改良效果[8]。然而菌渣還田對濱海鹽堿土的影響研究尚未見報道。

本試驗通過探究3種不同含鹽量的濱海鹽堿土區林地栽培大球蓋菇出菇后，其菌渣就地還田對鹽堿地土壤理化性質、養分含量以及真菌群落的影響，以期為大球蓋菇鹽堿地栽培及其菌渣還田改良鹽堿地技術的推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及材料

試驗地位于山東省林業科學研究院東營分院（E118°41′33″，N37°24′35″）栽植的白蠟林下，樹齡6年，株行距3m×4m，郁閉度0.7。土壤類型為中度～強度鹽化土，為典型的濱海林地鹽堿土（含鹽量2‰ ～6‰），土壤性狀背景值見表1。當地年均氣溫12.8℃，年均降水量555.9mm，年均日照時數2657.5h。

供試菌渣為2018年10月—2019年5月在鹽堿區林下栽培大球蓋菇出菇后的栽培基質。基質配方為稻殼45%、闊葉雜木屑38%、玉米芯10%、林地土5%、生石灰2%，666.7m2栽培料施用量6500kg。

1.2 試驗設計及方法

2019年6月3日出菇結束后，將3塊鹽堿地上的菌渣，用旋耕機就地旋耕于地下，深度20cm。菌渣施入量（自然干重，含部分土壤）約20kg/m2。小區面積30m2，每處理重復3次。各重復地塊之間相隔5m，對照組與處理組相隔10m。對照組只旋耕不添加菌渣。試驗處理見表2。

1.3 取樣方法

菌渣施入土壤自然降解4個月后，用環刀法取土樣用于測定土壤物理指標。通過五點法采集0～20cm土層土壤，上下層土混勻，四分法留取土樣，之后立即過2mm網篩，裝入已消毒的密封塑料袋中，液氮條件下保存帶回實驗室，一半用于測定土壤微生物指標，一半風干用于測定土壤理化指標。

1.4 土壤理化性質測定

土壤容重用環刀法測定，孔隙度（%）=（1-容重/土粒密度）×100，pH值采用pHS-2C型數字酸度計測定，電導率（EC5∶1）采用DDS-11A型電導儀測定，土壤水穩團聚體采用濕篩法測定，有機質含量采用重鉻酸鉀氧化-比色法測定，堿解氮采用擴散吸收法測定，有效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定，土壤含鹽量用電導率法測定[9]。

1.5 土壤真菌高通量測定

1.5.1 土壤微生物DNA提取、測序、處理 采用CTAB法[10]對所采樣本的基因組DNA進行提取。以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用帶Barcode的特異引物ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG - 3′）/ITS2 - 2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），以及高保真酶擴增ITS1區域。PCR反應程序為：94℃ 5min;94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 60s，30個循環;72℃延伸7min。

PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。使用TruSeq DNAPCR-FreeSamplePreparationKit建庫試劑盒進行文庫構建，文庫經過Qubit和Q-PCR定量，使用HiSeq2500PE250進行上機測序（北京諾禾致源生物信息科技有限公司）。根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數據（rawtags）;拼接得到的rawtags，參照Qiime的Tags質量控制流程，經過嚴格的過濾處理得到高質量的Tags數據（cleantags）[11，12]。經過以上處理后得到的Tags序列通過UCHIMEAlgorithm與數據庫Golddatabase進行比對，檢測并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據（effectivetags）[13，14]。

1.5.2 OTU聚類和物種注釋 利用Uparse軟件[15]對所有樣品的全部有效序列（effectivetags）進行聚類，默認以97%的一致性（identity）將序列聚類成為OTUs（operationaltaxonomicunits），同時選取OTUs中出現頻數最高的序列作為代表序列。用SSUrRNA數據庫[16]對代表序列進行物種注釋，獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。使用PyNAST軟件[17]與GreenGene數據庫中的“CoreSet”數據信息進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。最后以reads數最少的樣品為標準對各樣品的數據進行均一化處理，后續的Alpha多樣性和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。

1.6 數據處理

土壤理化性質數據及微生物相對豐富度數據采用MicrosoftExcel2010進行處理和圖表繪制;應用IBMSPSS21.0中的Duncan’s法進行單因素方差分析。使用Qiime軟件（Version1.7.0）計算土壤Observedspecies、ShannonWiener指數、Simpson指數、Chao1指數;使用R軟件進行Alpha多樣性、Beta多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 大球蓋菇菌渣對鹽堿土區林地土壤理化性質的影響

2.1.1 對土壤物理性質的影響 由表3看出，與各自對照相比，施入大球蓋菇菌渣的各處理土壤容重顯著降低，土壤孔隙度、水穩性團聚體顯著增加。其中，M1s、Z1s、Z2s處理土壤容重分別降低34.07%、46.58%、48.48%，土壤孔隙度分別增加28.78%、52.90%、52.50%，水穩性團聚體分別增加58.54%、111.33%、123.82%。各處理組間差異不顯著，對照組間比較，M1ck的土壤容重、土壤孔隙度與Z1ck、Z2ck間差異顯著，M1ck的水穩性團聚體與Z2ck間差異顯著。結果表明，施入大球蓋菇菌渣后顯著改善了濱海鹽堿土區林地的物理性質。

2.1.2 對土壤化學性質和養分的影響 由表4看出，與各自對照相比，施加大球蓋菇菌渣的各處理土壤EC值、含鹽量均顯著降低，土壤EC值分別降低40.43%、83.03%、88.98%，含鹽量分別降低45.45%、85.34%、90.42%;各處理組間EC值、含鹽量差異不顯著，各對照組間差異顯著。各處理土壤有機質、速效磷、堿解氮均顯著提高，土壤有機質分別提高87.15%、138.50%、238.90%，速效磷分別提高401.33%、642.28%、965.80%，堿解氮分別提高79.86%、179.57%、269.89%。各處理組間有機質、速效磷、堿解氮差異不顯著，各對照組間差異顯著（Z1ck與Z2ck速效磷除外）。

2.2 大球蓋菇菌渣對鹽堿土區林地土壤真菌群落的影響

2.2.1 對土壤真菌群落分布特征的影響 測定結果表明，各處理得到有效序列均超過55000個，OTUs數目在400～800之間。各處理真菌的相對豐富度在門水平上差異較大（圖1）。與其處理組相比，M1ck的球囊菌門Glomeromycota（0.17%），M1s的單毛壺菌門Monoblepharomycota（0.04%），Z1ck組的優被孢霉門Mortierellomycota（13.94%）、捕蟲霉門Zoopagomycota（0.002%），Z1s的羅茲菌門Rozellomycota（1.30%）、擔子菌門Basidiomycota（37.23%）、毛霉菌門Mucoromycota（0.003%），Z2ck的壺門菌Chytridiomycota（1.57%）、芽枝霉門Blastocladiomycota（5.19%），Z2s的梳霉門Kickxellomycota（0.002%）、新麗鞭毛菌門Neocallimastigomycota（0.003%）相對豐富度最高。

如圖2所示，除Z1s處理外，各處理的最優勢真菌群落是子囊菌門Ascomycota（>35%），Z1s的最優勢真菌群落為擔子菌門Basidiomycota（37.23%）;與各自對照相比，各處理的Ascomycota相對豐富度以及top10真菌群落的相對豐富度之和均顯著降低，M1s、Z1s、Z2s處理的Ascomycota相對豐富度分別降低33.87%、70.23%、29.18%，top10真菌群落的相對豐富度之和分別降低34.09%、27.06%、30.29%。這表明，施加大球蓋菇菌渣顯著降低濱海鹽堿地土壤子囊菌門及top10真菌群落的相對豐富度。

2.2.2 對土壤功能真菌豐富度的影響 如表5所示，鹽堿土區林地土壤中具有解磷功能的真菌有青霉屬Penicillium、曲霉屬Aspergillus、鐮刀菌屬Fusarium，具有解鉀功能的真菌有黑曲霉Aspergillusniger，具有生防功能的真菌有木霉菌屬Trichoderma、節叢孢屬Arthrobotrys，林木病原真菌有尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum。與各自對照相比，M1s處理的Penicillium、Fusarium、Aspergillusniger、Fusariumoxysporum相對豐富度顯著降低，Trichoderma、Arthrobotrys相對豐富度顯著增加，Z1s處理的Aspergillus、Fusarium、Fusariumoxysporum相對豐富度顯著降低，Z2s處理的Penicillium、Trichoderma相對豐富度顯著增加。這表明，施入大球蓋菇菌渣后，鹽堿土區林地土壤功能真菌豐富度變化顯著，其中中度鹽化地（M1s）的木霉菌屬、節叢孢屬分別增加604.11%、236.36%;強度鹽化地（Z2s）的青霉屬、木霉菌屬分別增加874.55%、218.10%;中度鹽化地（M1s）、強度鹽化地（Z1s）的尖孢鐮刀菌分別降低80.43%、74.44%，尖孢鐮刀菌為林木病原菌，其減少后有利于樹木健康生長。

2.2.3 對土壤真菌Alpha多樣性的影響 如表6所示，與對照相比，施入大球蓋菇菌渣的Z2s處理土壤真菌的物種數（Observedspecies）、豐富度指數（Chao1）、菌群多樣性指數（ShannonWiener與Simpson）均顯著增加，M1s、Z1s處理各指標與其對照相比變化不顯著（Z1s處理的Simpson除外）。

2.2.4 對土壤真菌Beta多樣性的影響 如圖3所示，各處理與各對照在MDS1軸上明顯分開。在MDS2軸上，3個對照也可明顯分開，但是3個處理聚集在一起。說明施入大球蓋菇菌渣后，不同鹽堿土區林地的真菌群落結構（Beta多樣性）顯著改變，且處理組的真菌群落分布特征趨于一致。

2.2.5 環境因子關聯分析 由圖4看出，X軸（CCA1）為第一主成分;Y軸（CCA2）為第二主成分;環境因子與處理組（M1s、Z1s、Z2s）的相關性大小排序為：孔隙度（porosity）>有機質（organic）>水穩性團聚體（aggregate）>pH值>含鹽量（salinity），表明孔隙度是影響處理組土壤真菌群落結構差異的最大因素。含鹽量、水穩性團聚體、有機質和孔隙度在X軸上的投影長度均明顯大于在Y軸上的投影長度，表明這4個變量主要影響對照組和處理組之間的真菌群落構成。含鹽量、pH值、有機質、水穩性團聚體、孔隙度與真菌群落組成的相關系數和P 值分別為（0.8970，0.0005）、（0.5370，0.0070）、（0.9700，0.0005）、（0.9214，0.0005）、（0.9532，0.0005），均達到顯著水平（P<0.05）。這表明，濱海鹽堿土區林地土壤含鹽量、pH值等理化性質與土壤真菌的群落結構顯著相關。

3 討論與結論

大球蓋菇菌渣含有大量有機質和多種微生物及酶等其他活性物質，將其就地翻混于林地鹽堿土4個月后，土壤容重降低34.07% ～48.48%，土壤孔隙度增加28.78% ～52.90%，水穩性團聚體增加58.54% ～123.82%，含鹽量降低45.45% ～90.42%，有機質增加87.15% ～238.90%，速效磷增加401.33% ～965.80%，堿解氮增加79.86% ～269.89%。這與謝修鴻等[18]關于姬松茸菌糠改良蘇打鹽堿土、陳世昌等[19]關于平菇菌渣改良普通耕作土以及胡留杰等[20]關于杏鮑菇等其他菌渣改良普通耕作土的研究結果較為相似，不同之處為本研究是出菇后就地還田，不需要將菌渣粉碎和二次發酵，其改良成本低，改良效果更為顯著。

施加大球蓋菇菌渣后，濱海鹽堿土區林地土壤微生物中的子囊菌門Ascomycota及top10真菌群落的相對豐富度顯著降低;中度鹽化地（M1s）的木霉菌屬、節叢孢屬分別增加604.11%、236.36%;強度鹽化地（Z2s）的青霉屬、木霉菌屬分別增加874.55%、218.10%;中度鹽化地（M1s）、強度鹽化地（Z1s）的尖孢鐮刀菌分別降低80.43%、74.44%。這可能是由于外源營養物質的施入，為真菌微生物提供了大量的營養物質，從而改變真菌微生物的群落豐富度所致[21]。

微生物群落結構可反映微生物競爭和協作等相互關系，群落結構影響微生物群落的功能和變化，從而導致土壤理化性質的改變[22，23]。本研究對濱海鹽堿土壤真菌群落Beta多樣性分析表明，菌渣對土壤真菌的群落結構改變顯著。濱海鹽堿地土壤微生物群落與環境因子的關聯分析結果表明，土壤真菌的群落結構與土壤孔隙度、有機質等理化性質顯著相關，這與陳莉莉等[24]關于土壤微生物群落與土壤理化性質的相關性結果較為一致。但本研究表明，鹽堿土區林地土壤真菌微生物群落的豐富度變化幅度更大。其原因為，大球蓋菇林地栽培特點是栽培基質數量大，菌渣還田4個月測量數據時，剩余的菌絲和菌渣還未完全降解，之后隨著菌渣降解時間的延長，土壤群落豐富度變化趨勢會相對穩定，本實驗室前期研究已經得到驗證[8]。

大球蓋菇林地栽培出菇后，出菇畦面上仍有約20kg/m2的菌渣留在土壤中，菌渣剩余量大，就地翻混還田改良土壤成本低。本試驗表明：濱海鹽堿土施加大球蓋菇菌渣后，土壤EC值、含鹽量及土壤容重均顯著降低;土壤孔隙度、有機質、速效磷、堿解氮含量均顯著提高;土壤中子囊菌門Ascomycota及top10真菌群落的相對豐富度顯著降低;強度鹽化地（Z2s）土壤真菌群落豐富度顯著提高，Alpha多樣性顯著提高;鹽堿地土壤真菌群落的Beta多樣性顯著改變;鹽堿地理化性質與土壤真菌群落結構顯著相關。本研究結果為濱海鹽堿土的改良探討了一條新的有效途徑。