黃蜀葵花不同開放程度對(duì)藥材中總黃酮及其糖苷類成分含量及其提取率的影響

郭小藤，劉燕，張清華，尚立霞

(1.山東省藥學(xué)科學(xué)院泰山學(xué)者重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵[Abelmoschusmanihot(L.) Medic.]的干燥花冠(帶雄蕊及花柱)，味甘性寒，歸腎及膀胱經(jīng)；具有清利濕熱、消腫解毒的功效；內(nèi)服用于濕熱壅遏和淋濁水腫；外治癰疽腫毒，水火燙傷[1]。它作為藥用始于宋代[2]，其后歷代本草均有記載，民間應(yīng)用歷史悠久，并收載于各版《中國(guó)藥典》以及江蘇、山東等一些地方藥材標(biāo)準(zhǔn)中。黃蜀葵花原產(chǎn)于我國(guó)南方，喜溫暖濕潤(rùn)，現(xiàn)除西北地區(qū)外，全國(guó)各地均有栽培，主要產(chǎn)區(qū)有江蘇、浙江以及安徽等[3-4]。黃蜀葵花含有上千種化合物，主要包括黃酮類、還原糖類、鞣質(zhì)、甾醇類、多糖類化合物以及其他成分，其中黃酮類化合物為黃蜀葵花的主要活性成分，黃酮類成分中又以金絲桃苷和異槲皮苷含量最高[5-8]。藥理學(xué)研究表明，黃蜀葵花的黃酮類成分具有保護(hù)心、腦缺血，改善肝、腎功能以及修復(fù)口腔黏膜潰瘍等作用[9-10]。臨床應(yīng)用黃蜀葵花及其總黃酮治療多種口腔炎癥、慢性支氣管炎，止痛效果顯著，對(duì)慢性腎小球腎炎有明顯療效[11]。

中藥材的采收、加工是其生產(chǎn)和品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，對(duì)確保中藥材質(zhì)量和臨床療效有著十分重要的意義。歷版《中國(guó)藥典》僅規(guī)定黃蜀葵花于夏、秋二季花開時(shí)采摘，及時(shí)干燥。但目前關(guān)于黃蜀葵花開放程度對(duì)藥材質(zhì)量影響的相關(guān)報(bào)道尚少。因此，為了保證黃蜀葵花藥材質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)和均一，本研究以金絲桃苷和異槲皮苷為對(duì)照品，采用紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法對(duì)黃屬葵花藥材中總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷成分進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)采用正交試驗(yàn)確定的總黃酮提取最佳工藝，考察藥材的提取率，評(píng)價(jià)黃蜀葵花不同開放程度時(shí)藥材的質(zhì)量，為黃蜀葵花的合理開發(fā)及利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備 Waters e2695高效液相色譜儀(2998PDA二極管陣列檢測(cè)器，Waters Empower工作站，均為美國(guó) Waters公司)；Agilent 8454 UV-Vis分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫)；Mettler XS-205電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)；DNT-0.1/00多功能提取濃縮機(jī)組(浙江溫兄機(jī)械閥業(yè)有限公司)；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；KQ2200DA 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)：111521-201809，含量:94.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；異槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)：111809-201804，含量:97.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；黃蜀葵花藥材產(chǎn)地均為江蘇，經(jīng)山東省藥學(xué)科學(xué)院泰山學(xué)者重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為錦葵科植物黃蜀葵[Abelmoschusmanihot(L.) Medic.]的干燥花；乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純，超純水為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 黃蜀葵花藥材的外觀性狀是其質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要部分，由于黃蜀葵花不屬于大宗藥材，市售黃蜀葵花藥材外觀性狀差異較大，因此本研究對(duì)黃蜀葵花藥材的花形及開放程度、花色進(jìn)行了觀察，并考察了外觀性狀與含量之間的相關(guān)性。江蘇是黃蜀葵花藥材種植規(guī)模較大的省份，花期為8—10月，本試驗(yàn)選用的藥材均為江蘇種植且在花期內(nèi)不同開放程度的藥材。

經(jīng)過對(duì)6批藥材樣品外觀性狀的觀察，發(fā)現(xiàn)其花形基本分為全開放形或半開放形、未開放螺旋卷狀形等開放程度；花色分為亮黃色或黃色、黃色偏綠等顏色。其中全開放的花，花瓣大而舒展，花色為亮黃色；半開放的花，花瓣沒有完全展開，花色多為黃色；未開放的花，花形為卷曲螺旋狀，外層花瓣呈淺綠色，結(jié)果見表1、圖1～2。

表1 黃蜀葵花藥材來源及外觀性狀

A.全開放形；B.半開放形；C.未開放螺旋卷形圖1 黃蜀葵花藥材不同花形樣品

A.亮黃色；B.黃色；C.黃色偏綠圖2 黃蜀葵花藥材不同花色樣品

2.2 黃蜀葵花藥材的提取 分別取不同開放程度的黃蜀葵花藥材各4 kg，加85%乙醇回流提取兩次，第一次12倍量，第二次10倍量，每次提取1 h，提取液濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.18～1.20(60 ℃)。將醇提濃縮液靜置16～20 h，撇去上層油，即得醇提浸膏。分別稱定醇提浸膏和油層的重量，計(jì)算本品醇提浸膏得率，結(jié)果見表2。

表2 黃蜀葵花藥材提取結(jié)果

全開放的黃蜀葵花提醇提出膏率最高，油層最少；半開放的黃蜀葵花出膏率略低于全開放的花，去油率偏高；未開放的黃蜀葵花醇提浸膏出膏率最低，去油率高且油層結(jié)實(shí)。

2.3 總黃酮含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液的制備 取不同開放程度的黃蜀葵花藥材樣品粉末(過四號(hào)篩)0.5 g，每個(gè)樣品各2份，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。取不同批次的醇提取樣品0.15 g，置25 mL量瓶中，精密稱定，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，離心10 min，取上清液備用。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷80 μg的溶液，即得。

2.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取對(duì)照品溶液3 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取供試品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；以50%甲醇為空白，在200～800 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線。結(jié)果表明，金絲桃苷對(duì)照品與供試品溶液在256 nm波長(zhǎng)處均有相同的最大吸收。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。以50%甲醇為空白，照紫外-可見分光光度法在256 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：C=0.052 1A-0.001 1(R2=0.999 99)，線性范圍為3.036 8～18.221 0 μg·mL-1。

2.3.5 含量測(cè)定 精密量取藥材供試品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，精密量取醇提浸膏供試品溶液1.0 mL，置50 mL量瓶中，分別加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在256 nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中金絲桃苷的量，計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果見表3。

表3 不同開放程度黃蜀葵花及醇提浸膏總黃酮含量測(cè)定結(jié)果(%,n=2)

全開放的黃蜀葵花樣品中總黃酮含量及醇提轉(zhuǎn)移率最高，半開放的黃蜀葵花總黃酮含量及醇提轉(zhuǎn)移率略低于全開放的花，未開放的黃蜀葵花總黃酮含量和醇提轉(zhuǎn)移率均最低，醇提浸膏中總黃酮含量趨勢(shì)與藥材基本一致。

2.4 金絲桃苷、異槲皮苷含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)，流速 1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35 ℃。

2.4.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷和異槲皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷100 μg、異槲皮苷60 μg的混合溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過四號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入甲醇15 mL超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取不同批次的醇提取樣品0.15 g，置25 mL量瓶中，精密稱定，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.4.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖3)。供試品溶液的色譜圖中，在與對(duì)照品溶液的色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且金絲桃苷峰、異槲皮苷峰與相鄰峰之間的分離度均符合要求。

A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液 1.金絲桃苷 2.異槲皮苷?qǐng)D3 黃蜀葵花高效液相色譜圖

2.4.5 樣品含量測(cè)定 分別取黃蜀葵花不同部位藥材粉末及不同批次的醇提取樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算金絲桃苷、異槲皮苷含量，結(jié)果見表4。

表4 不同開放程度黃蜀葵花及醇提浸膏金絲桃苷、異槲皮苷含量測(cè)定結(jié)果(%,n=2)

全開放的黃蜀葵花樣品中金絲桃苷、異槲皮苷平均含量最高，半開放的黃蜀葵花中兩成分平均含量略低于全開放的花，未開放的黃蜀葵花中兩成分平均含量均最低，醇提浸膏中兩成分含量趨勢(shì)與藥材基本一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取溶劑及方法考察 黃酮類成分是黃蜀葵花的有效部位，由于黃酮類成分在水中溶解度不高，多采用適當(dāng)濃度的甲醇或乙醇作為溶劑，采用加熱回流、超聲或索氏等方法進(jìn)行提取[12-13]。由于索氏和超聲提取僅適合少量藥材的提取，且甲醇的毒性較大，而乙醇具有價(jià)格低、易回收、污染小等優(yōu)點(diǎn)，因此本研究采用的乙醇回流提取的方法最適合放大生產(chǎn)。在醇提取工藝研究中，以總黃酮的含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察對(duì)總黃酮提取率的影響，最終選定了最佳的提取工藝條件。

3.2 藥材性狀的選擇 黃蜀葵花藥材醇提液濃縮靜置后，提取浸膏上層有一層油狀物，分析是由花托中的葉綠素及花蕊中的多糖、果膠等成分組成[14]。本研究通過試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)未開放及半開放的黃蜀葵花藥材醇提去油率較高，分析是由于未完全開放的花瓣將花蕊包裹，保留了較多的多糖及果膠成分，不利于有效部位的分離純化。因此在對(duì)黃蜀葵花總黃酮有效部位分離純化時(shí)，應(yīng)優(yōu)選完全開放的花進(jìn)行提取，同時(shí)對(duì)藥材的花托比例進(jìn)行限定。

3.3 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇 目前對(duì)黃蜀葵花藥材含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道多為單獨(dú)測(cè)定總黃酮有效部位或單獨(dú)測(cè)定金絲桃苷、異槲皮苷等單成分含量[15-16]。本研究不僅對(duì)黃蜀葵花藥材不同部位的總黃酮總量進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)對(duì)總黃酮中含量及活性最高的指標(biāo)成分金絲桃苷、異槲皮苷進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明黃蜀葵花中總黃酮含量較高時(shí)，金絲桃苷和異槲皮苷含量也較高，二者呈一定相關(guān)性，更全面的評(píng)價(jià)了黃蜀葵花藥材的質(zhì)量，為進(jìn)一步研究有效部位與單成分之間的相關(guān)性和藥理藥效的機(jī)理提供了數(shù)據(jù)支持。

3.4 不同開放程度藥材含量分析 黃蜀葵花中總黃酮、金絲桃苷及異槲皮苷含量趨勢(shì)為：黃色全開放花>黃色半開放花>偏綠色未開放花。全開放的黃蜀葵花，顏色為亮黃色，花瓣大而舒展，有效成分含量高，提取轉(zhuǎn)移率高，去油率低；未開放的黃蜀葵花，花瓣卷曲呈螺旋狀，由于其尚未開放即進(jìn)行采摘，花朵接收的陽光光照不足，其外層花瓣呈淺綠色，有效成分含量偏低，提取轉(zhuǎn)移率低；半開放的黃蜀葵花，其顏色為黃色，花瓣沒有完全展開，有效成分的含量居于前兩者之間。從上述結(jié)果可以看出，黃蜀葵花藥材的質(zhì)量與其開放程度密切相關(guān)，由于該花只有一天開放時(shí)間，因此采收時(shí)間宜在晴天的白天花朵完全開放后當(dāng)天采摘，過早采摘未開放的花將影響藥材的質(zhì)量。在黃蜀葵花15個(gè)樣品中，S1～S5樣品顏色較其他樣品偏綠，同時(shí)各成分含量較其他樣品偏低，說明黃蜀葵花中黃酮類成分的含量可能與其顏色有一定的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

3.5 結(jié)論 總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷作為黃蜀葵花中主要活性成分，其含量高低直接影響黃蜀葵花的內(nèi)在質(zhì)量及臨床療效。本研究以總黃酮有效部位、金絲桃苷及異槲皮苷和醇提轉(zhuǎn)移率為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)不同開放程度的黃蜀葵花藥材進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明，黃蜀葵花藥材不同的開放程度對(duì)總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷的含量均有影響，亮黃色全開放花中總黃酮、金絲桃苷及異槲皮苷的含量最高。