基于定癇湯干預后癲癇小鼠海馬區miRNA-204表達水平的變化及腦電圖變化的研究

盧玲，刁麗梅，李歡，廖現秋

(1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023)

癲癇是影響全球超過7000萬人的最常見的慢性腦部疾病之一，它極大地影響了患者的生活質量，并且對患者的健康造成了嚴重的威脅[1-2]。目前的抗癲癇藥物能夠減輕患者的癥狀，但不能抑制致癇過程的發展，且長期使用也會引起各種不良反應，亦會使藥物的敏感性降低[3]。故而，研發療效高、安全性好且副作用小的藥物以及新型治療方法具有重要的臨床意義。

癲癇的發病機制尚不明確，因此了解癲癇發病所涉及的生物過程是研發新治療方法和藥物的基礎。有研究表明，微小核糖核酸(miRNAs)的異常表達與癲癇的發病機制密切相關[4]。miRNAs在中樞神經系統中廣泛表達，它能夠參與中樞神經系統的分化、發育和成熟，且能夠密切調節突觸的可塑性，從而調節癲癇的發作[5]。而自噬在多種神經退行性疾病中同樣扮演著重要的角色，也跟癲癇的發生發展密不可分[6]。

近年來，中藥在治療癲癇方面表現出了獨特的優勢，它能夠減少癲癇的并發癥，降低抗癲癇藥物的副作用，提高患者的依從性。定癇湯是一個歷史悠久治療癲癇的經典方劑，具有化痰熄風，開竅止痙的功效。目前眾多臨床研究表明，定癇湯能夠較好地提高癲癇治療的療效，改善癲癇的發作[7-8]。此外，實驗研究表明定癇湯通過調節抗炎、抗氧化、神經保護等，發揮抗癲癇功效，以降低癲癇大鼠的發作頻率，延長發作的潛伏期，減少大鼠腦電圖的癇性波形[9-10]。本課題組前期的基礎研究發現定癇湯的抗癲癇機制可能與其對miRNAs的調控作用有關。因此，我們前期的基礎研究對癲癇小鼠miRNAs進行了基因芯片檢測，發現miRNA-204在癲癇小鼠的海馬組織中表達下調[11]。因此，本實驗研究定癇湯干預后，小鼠腦電圖的變化，癲癇小鼠海馬區miRNA-204表達的變化，及自噬相關蛋白(ATG7和LC3II)的表達變化，探究定癇湯治療癲癇的可能療效機制。

1 材料

1.1 主要實驗儀器

視頻腦電圖儀NATION7128W(上海諾誠電氣股份有限公司)；光學顯微鏡BX43(日本Nikon)；Ariamx型實時熒光定量PCR儀(安捷倫科技有限公司)；低溫離心機(德國eppendorf公司)；VeritiTM96-Well Thermal Cycler(美國Applied Biosystems公司)；超微量核酸檢測儀(杭州遂真生物技術有限公司)。

1.2 主要實驗試劑

BSA(Servicebio 公司 G5001)；DAB 顯色劑(Servicebio公司 G1211)；Anti-LC3II抗體(博奧森公司 bs-2912R)；Anti-ATG7抗體(博奧森公司 bs-2432R)；檸檬酸(PH 6.0)抗原修復液(Servicebio 公司 G1202)；PBS 緩沖液(Servicebio 公司 G0002)；正常兔血清(Servicebio 公司 G1209)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) (Takara公司 RR047A)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara公司 RR820A)。

1.3 實驗動物

健康昆明小鼠，雄性，體質量20～22 g，周齡8～10周，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供(許可證號：SYXK桂2009-0001)。分籠飼養，每籠5只，室溫22～23 ℃，12 h交替光照，給予SPF級飼料和飲用水。所有小鼠均需適應環境2周及以上方可進行實驗操作。實驗動物的飼養和操作均在SPF級環境中進行，且實驗過程嚴格遵照廣西中醫藥大學動物倫理委員會的各項規定。

1.4 主要實驗藥物

定癇湯組成：天麻12 g，茯神12 g，姜半夏9 g，膽南星9 g，川貝母12 g，茯苓12 g，石菖蒲9 g，僵蠶10 g，全蝎6 g，琥珀6 g，陳皮12 g，遠志10 g，丹參15 g，麥冬15 g，朱砂0.5 g，甘草6 g，所有藥材均由廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科統一采購備用，采用自動煎藥機煎煮，濃縮至藥物濃度500 mg/mL；鹽酸匹羅卡品(Pilocarpine Hydrochloride,美國Sigma公司),硫酸阿托品注射液(鄭州鈴銳制藥有限公司)。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

將40只健康雄性昆明小鼠按隨機數字表法隨機分為4組，分別為：模型組、生理鹽水組、卡馬西平組、定癇湯組。分別對各組動物進行灌胃2周，模型組和生理鹽水組均予20 mL·kg-1·d-1生理鹽水進行灌胃；定癇湯組予7 g·kg-1·d-1定癇湯藥液進行灌胃；卡馬西平組予30 mg·kg-1·d-1卡馬西平混懸液灌胃。灌胃2周后，對模型組、卡馬西平組、定癇湯組實驗動物進行造模。造模時，先使用硫酸阿托品(17 mg/kg)進行腹腔注射；30 min后，再使用Pilocarpine Hydrochloride(180 mg/kg)進行腹腔注射；小鼠給藥完畢后，按照經典的Racine(1972)的實驗動物癇性發作標準對小鼠進行行為學觀察[12]。若腹腔注射30 min后，小鼠未能出現Ⅳ級以上癇性發作的，則每隔15 min對小鼠進行追加腹腔注射，追加注射的Pilocarpine Hydrochloride劑量為：首劑量的1/3。若追加Pilocarpine Hydrochloride腹腔注射2次以后，小鼠仍未能出現Ⅳ級以上癇性發作的，則視其為造模失敗，不再納入下一步行為學觀察及后續實驗。若小鼠癇性發作持續時間達到1 h，則給予地西泮腹腔注射，以終止癇性發作。本實驗的對照組生理鹽水組小鼠給予注射等量的生理鹽水。

2.2 腦電圖檢測

將各組小鼠分別進行固定制動，再將腦電圖儀的針電極分別插入小鼠左右顳骨的表面,并與同側耳電極連接，待固定平穩后監測并記錄各組小鼠的腦電圖。將紙速設定為：3 cm/s，將波形敏感度設定為：80 μV/cm。

2.3 熒光定量PCR檢測miR204表達量

2.3.1 RNA提取及逆轉錄

各組小鼠海馬組織分別剪成細小的碎片，取50～100 mg放入2 mL離心管置于冰盒上，加入1 mL TriQuick Reagent，用勻漿機勻漿至無沉淀。勻漿靜置(室溫)5 min，加入0.2 mL氯仿，震蕩15 s，靜置(室溫)2 min；4 ℃離心，12 000 r/min離心15 min，取上清0.5 mL加入潔凈的1.5 mL離心管；加入0.5 mL異丙醇，混勻，靜置(室溫)10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清；先后加入兩次1 mL的75%乙醇，依次進行洗滌沉淀，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清；再加入1 mL無水乙醇，重復上述操作；隨后置于65 ℃金屬浴鍋上烘干沉淀，加0.03 mL DEPC水溶解。使用超微量核酸檢測儀進行RNA濃度及純度檢測后進行逆轉錄操作，所得cDNA置于-80 ℃保存待用。

2.3.2 qPCR檢測

qPCR反應體系為：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ:10 μL，cDNA：1 μL，Primer Forward(10 μmol/L)：0.4 μL，Primer Reverse(10 μmol/L)：0.4 μL，H2O：8.2 μL；反應程序：預變性95 ℃ 30 s,PCR循環(40循環)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s;溶解曲線：標準溶解曲線程序。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2.4 免疫組化檢測自噬相關蛋白ATG7、LC3 II表達情況

使用甲醛對小鼠腦組織進行固定，通過石蠟進行包埋。然后將小鼠腦組織以3～5 μm為厚度進行冠狀切片。組織切片經烘烤(60 ℃恒溫箱)30 min后，再置于二甲苯中進行浸泡，浸泡時間為15 min；更換二甲苯后再次浸泡15 min；再將切片依次置于二甲苯∶乙醇=1∶1混合液、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水中分別浸泡10 min；隨后用蒸餾水室溫封閉10 min；然后進行抗原修復，修復過程為：將組織切片置于盛滿使用檸檬酸(pH 6.0)抗原修復液的修復盒中于微波爐內，先中火加熱8 min至煮沸，然后停火靜置8 min，保溫再轉中低火維持7 min；修復完成后對內源性過氧化物酶進行阻斷；隨后進行血清封閉；加入一抗孵育過夜；回收一抗，TBS 洗2遍，每次5 min；加入二抗，室溫孵育50 min；TBS 洗4遍，每次5 min；加入DAB進行顯色；用蘇木精復染細胞核；再依次將切片置于蒸餾水、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯∶乙醇=1∶1混合液、二甲苯中浸泡5 min，隨后更換二甲苯再次浸泡5 min，進行脫水封片；晾干、觀察結果。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 各組小鼠行為學表現

對各組小鼠分別進行行為學觀察，觀察結果顯示,生理鹽水組在觀察過程中未出現任何癇性發作癥狀；模型組小鼠造模成功后，主要表現為弓背、二便失禁、后腿直立、前腳陣攣、尾巴豎起等，且模型組小鼠癲癇發作頻率及持續時間均最長；卡馬西平組和定癇湯組癇性發作的頻率較模型組減少，且發作持續時間較模型組明顯縮短。結果表明,定癇湯和卡馬西平對小鼠癲癇發作具有抑制作用。

3.2 各組小鼠腦電圖分析

腦電圖結果顯示，生理鹽水組小鼠腦電圖表現為正常波形；而在模型組中可見較多的棘波、尖波和棘慢波頻繁發放；在卡馬西平治療組中，仍可見少量尖波、棘波；在定癇湯治療組中，也可見少量尖波、棘波發放，見圖1。結果表明，定癇湯、卡馬西平治療后，癲癇小鼠的腦電圖棘波、尖波、棘慢復合波可顯著減少。定癇湯可抑制癲癇小鼠的癇性放電。

圖1 各組小鼠腦電圖情況

3.3 定癇湯對癲癇小鼠海馬區miRNA-204的表達水平的影響

模型組的miRNA-204表達水平較生理鹽水組下調，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，定癇湯組和卡馬西平組miRNA-204表達上調(P<0.01)；定癇湯組與卡馬西平組相比較，小鼠海馬區miRNA-204的表達差異無統計學意義，見圖2。實時熒光定量PCR的結果表明,定癇湯干預后癲癇小鼠海馬組織miRNA-204的表達較模型組上調。

注：與生理鹽水組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01。圖2 各組小鼠海馬中miRNA-204的表達水平

3.4 各組自噬相關蛋白ATG7、LC3II在小鼠海馬組織中表達情況比較

本實驗免疫組化結果表明：ATG7和LC3 II這兩個自噬相關蛋白在模型組小鼠海馬組織中高表達，兩者陽性細胞比例均高于生理鹽水組(P<0.01)；定癇湯組、卡馬西平組的小鼠海馬組織中ATG7、LC3II蛋白表達下調，兩組陽性細胞比例較模型組明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 自噬相關蛋白在各組小鼠海馬組織中的陽性細胞數比例

4 討論

癲癇作為神經系統的常見疾病之一，反復發作導致患者日常工作和生活受到影響，長期的癲癇發作亦會使患者出現認知功能障礙、抑郁和焦慮等，給患者和社會帶來了巨大的經濟負擔[13]。定癇湯由天麻、姜半夏、石菖蒲、全蝎、遠志等16味藥物組成，它與抗癲癇藥物聯合使用能夠明顯減少腦電圖的癇性波、減少藥物的不良反應、改善患者的癥狀、減少癲癇發作的頻率，同時能夠極大提高患者的依從性，常用于癲癇的臨床治療。既往的臨床研究也進一步證實了定癇湯在癲癇治療中的療效[7]。此外，近年來的基礎研究也表明，定癇丸可能通過抑制海馬神經元細胞的凋亡，達到抗癲癇作用[14]。該中藥復方中的天麻可能通過調節神經元細胞的電生理穩態、調節神經遞質的平衡發揮抗癲癇作用[15]。半夏的抗癲癇機制可能與其增加大鼠海馬γ-氨基丁酸的含量，提高γ-氨基丁酸的功能密切相關[16]。石菖蒲揮發油能夠抑制神經細胞的凋亡，是一種長效的、抗癲癇譜廣的抗癲癇藥物[17]。全蝎的提取物具有良好的抗驚厥、抗癲癇和鎮靜作用，能夠有效地減少小鼠癲癇發作的頻率，延長驚厥的潛伏期[18]。而遠志總皂苷能夠改善癲癇繼發的認知功能障礙，其可能的機制是遠志總皂苷能夠提高癲癇大鼠海馬區煙堿型乙酰膽堿受體ɑ7亞基的表達[19]。為明確定癇湯的療效，本實驗使用定癇湯干預癲癇小鼠，并且對小鼠進行行為學和腦電圖觀察。結果表明，定癇湯能夠明顯縮短小鼠癲癇發作的持續時間、減少小鼠腦電圖的棘波、尖波等癇性波的發放。

miRNAs是一種內源性短非編碼核糖核酸。其在血液、組織和尿液中都具有穩定性，是疾病診斷的潛在生物標志物。研究發現，miRNAs可以調節膽堿能平衡、海馬神經元的增殖和丟失以及神經炎癥，在癲癇的發生和發展中起著關鍵的作用[13,20]。miRNA-204在癲癇患者海馬區中表達下調，它能夠抑制海馬神經元中的癲癇樣放電，是癲癇治療的潛在靶點[21]。本課題組前期的基因芯片檢測發現，miRNA-204在癲癇小鼠海馬組織中表達下調。加味柴胡疏肝湯可能通過上調miRNA-204，保護海馬神經元，抑制小鼠海馬神經元的過度自噬，從而發揮抗癲癇作用[22]。本實驗通過實時熒光定量PCR技術進一步證實了miRNA-204在癲癇小鼠中表達下調(P<0.01)，采用定癇湯干預后癲癇小鼠海馬組織miRNA-204表達上調(P<0.01)。因此，定癇湯可能通過上調miRNA-204發揮抗癲癇作用。

自噬是一種在細胞中發揮作用的分解代謝過程，異常的自噬會對細胞分解代謝產生影響，從而導致細胞損傷。自噬存在于各種神經系統疾病中，在神經元損傷中起著關鍵作用，與癲癇的發生發展密切相關[23]。LC3 II是一種自噬相關蛋白，已經證實其在癲癇小鼠中表達上調并導致神經元的損傷[24]。ATG7是自噬體形成所必須的蛋白酶，它也是自噬的重要標志蛋白之一[25]。本課題組既往研究表明，上調miRNA-204可以抑制ATG7和LC3 II的過度表達，從而抑制自噬的發生，起到干預癲癇的發生發展的作用[22]。本實驗通過免疫組化技術，進一步發掘了定癇湯對自噬的干預作用。在癲癇小鼠海馬中，自噬相關蛋白ATG7和LC3 II的表達上調(P<0.01)；而定癇湯能夠下調ATG7和LC3 II的表達(P<0.01)，從而達到治療癲癇的目的。

總而言之，miRNA-204調控自噬相關蛋白ATG7和LC3 II的表達，導致海馬神經元損傷，誘發自噬是癲癇發生發展的可能機制之一。定癇湯能夠減短癲癇發作的持續時間、改善癲癇小鼠腦電圖的癲癇樣波形，其可能是通過上調miRNA-204的表達，抑制ATG7和LC3II的過度表達，抑制小鼠海馬神經元自噬，發揮治療癲癇的療效。