多環芳烴共代謝對苯并[a]蒽微生物降解的影響及機制

朱清禾,曾 軍,吳宇澄,楊 潔,林先貴*

多環芳烴共代謝對苯并[a]蒽微生物降解的影響及機制

朱清禾1,2,曾 軍1,吳宇澄1,楊 潔2,林先貴1*

(1.中國科學院南京土壤研究所,土壤環境與污染修復重點實驗室,江蘇 南京 210008；2.上海市環境科學研究院,國家環境保護城市土壤污染控制與修復工程技術中心,上海 200233)

利用14C同位素示蹤技術,研究土壤中菲、蒽、芘3種底物對苯并[a]蒽(BaA)環境歸趨的影響,高通量測序解析細菌群落響應.結果表明,3種底物均可以促進BaA的降解,添加蒽作為共代謝底物后,BaA礦化率比對照提高了2.5%,而添加菲、芘時,14C在土壤的結合態比對照升高4%,達總添加量的31%.共代謝底物改變了細菌共生網絡的拓撲結構:添加底物蒽后,網絡中的正連接比例顯著升高,物種間以共生關系為主;菲、芘作為共代謝底物時,細菌物種間的負連接比例升高,暗示微生物種群競爭變激烈.推測蒽與BaA化合物結構相似并有相近的代謝途徑,細菌共生性增強并直接促進了BaA的礦化.

苯并[a]蒽；環境歸趨；共代謝；細菌共生網絡

多環芳烴(PAHs)是一類主要由人類生產生活產生的稠苯類化合物,一般具有致癌、致畸、致突變的三致效應,是土壤及地下水環境中重點管控污染物[1].高分子量PAHs(四環及以上),生物利用性低,在土壤中更易于持久殘留,成為PAHs污染土壤修復的重點與難點.

共代謝是指添加另一種化合物作為碳源促進微生物降解有機物的過程,是提高PAHs生物降解的常用手段之一.已知的PAHs共代謝底物包括:簡單的有機酸(如水楊酸、鄰苯二甲酸、香草酸)[2-3]、低分子量PAHs(如萘、芴、菲)[4]、石油烴等.李政等[4]發現,芴、菲可以將芘的降解效率提高35%左右,并且芴和菲還能加速芘中間產物的去除,減少環境的二次污染.對比不同類型的共代謝底物,小分子PAHs的共代謝效果甚至可能優于有機酸[5],菲可以將紅壤中的苯并[a]芘的轉化率提高至70%,顯著高于對照(50%),而鄰苯二甲酸對紅壤苯并[a]芘降解率影響不明顯.有研究者認為共代謝底物結構是影響PAHs效率的重要因素:底物與污染物結構相似性越高,共代謝發生的概率越大[6].底物在降解過程刺激相關功能菌的生長,進而影響相關功能酶活性,例如萘、菲能夠提高多酚氧化酶活性[7]、木質素則增強原兒茶酸-4,5-雙加氧酶[3]等,這些非特異性酶類增強表達可轉化高環PAHs,從而促進微生物共代謝降解.

污染物進入土壤除了被微生物降解礦化形成CO2外,還會與土壤有機質結合生成結合態殘留[8],這兩種去向都可以促進土壤中污染物的解毒,但背后的機理及對環境的影響存在差異,其中礦化是污染物最徹底的解毒方式.目前,PAHs共代謝降解作用機制多在模擬體系下進行,而在真實土壤介質中開展的研究相對較少.Sun等[3]研究發現,盡管香草酸是木質素的單體,兩者有類似的結構單元,對微生物的影響有相似之處,但兩者對BaA的環境歸趨影響存在差異:木質素主要促進BaA土壤結合態的生成,而香草酸可以提高BaA的礦化率,這種差異可能來自于微生物群落及代謝途徑.微生物是污染物降解的主要驅動力,也是影響污染物環境歸趨的重要因素[9],共代謝底物對微生物的影響會改變污染物降解過程及環境去向.盡管有研究者認為共代謝底物與污染物結構類似時,更易促進污染物的降解,但其機制仍有待進一步探索.本研究選擇菲、蒽、芘3種PAHs作為共代謝底物,以BaA為土壤中代表性的難降解PAHs污染物,分析共代謝底物結構對BaA在各處理土壤組分間分配及土壤細菌群落響應,為發展高分子量PAHs污染土壤共代謝修復技術提供支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

采集南京梅山寶鋼周邊的農田表層土壤(31.90°N, 118.61°E),土壤性質如表1所示,挑出植物根系,風干、磨碎,過2mm篩備用.菲、蒽、芘、BaA購自Sigma-Aldrich公司,[7, 12-14C]BaA(購自于American Radiolabeled Chemicals, Inc. Missouri, USA),污染物提取過程中所用到的試劑(如二氯甲烷、正己烷等)均購自于國藥集團化學試劑有限公司.FastDNA?SPIN Kit for Soils試劑盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA)用于提取土壤中微生物的DNA.

表1 供試土壤理化性質

1.2 實驗方法

人工污染土壤的配制:稱取適量的帶標記和未標記的BaA,混合后溶于丙酮,配制成5mg/mL、33kBq/mL BaA溶液,將上述溶液以10%的比例,少量多次分別加入供試土樣中并攪拌均勻,得到500mg/kg、3.3kBq/g的BaA污染土壤.用相似的方法分別配制未標記的菲(50mg/kg)、蒽(50mg/kg)、芘(50mg/kg)污染土壤,將以上人工污染土壤置于通風櫥中揮發丙酮過夜.稱取BaA污染土壤1g、菲污染土壤1g及未污染的土樣3g于礦化管中并混合均勻,得到BaA(終濃度100mg/kg)、菲(終濃度10mg/kg)混合污染土壤.用相同的方法配制蒽-BaA及芘-BaA混合污染土壤.調節含水量至土壤最大持水量的60%,28℃暗室恒溫培養2個月.礦化管用橡膠塞封口,并在橡膠塞下懸掛一個塑料小管,其中裝入1mL 1mol/L NaOH溶液,用于吸收釋放的CO2.培養結束后,用液體閃爍分析儀(LSC, Beckman-Coulter, USA)測定NaOH中14CO2的含量,收集培養的土壤,一部分風干后分析污染物在不同組分間的分配,另一部分土壤于-40℃分析微生物群落.

1.3 PAHs可提取態和結合態的測定

污染物土壤可提取態:將風干后的土壤研磨過20目篩,取2.0g過篩土壤,置于索氏提取儀中,二氯甲烷提取24h.旋轉蒸干二氯甲烷后加入2mL環己烷溶解PAHs,C-18柱(3mL:0.5g)固相萃取法純化浸提液,洗脫液(體積比正己烷:二氯甲烷=1:1).得到可提取態的污染物,取1mL洗脫液測定標記量.

胡敏素結合態:將二氯甲烷提取后的土樣風干,取1.5g該土樣于10mL的離心管中,在氮氣保護的狀態下加入6mL 0.1mol/L NaOH溶液.250r/min速度振蕩24h后,16000離心30min(Eppendorf 5804R,德國),沉淀為胡敏素,上清液為腐殖酸與富里酸的混合溶液.盡量倒盡剩余提取液,將沉淀(胡敏素)冷凍干燥后(完全去水),取約0.5g(計量)碾磨樣品燃燒法測定標記量

腐殖酸與富里酸結合態:取出上述富里酸+腐殖酸提取液(約4mL),吸取0.5mL(計量)測定標記,得到混合溶液的標記量.另取2mL(計量)上述腐殖酸與富里酸混合溶液,加入6mol/L HCl調節至pH=1.0,4℃沉淀24h.5100g離心10min,吸取上清測定即為富里酸結合態的標記物.

NaOH溶液、富里酸溶液、混合溶液(富里酸、腐殖酸)中的標記物含量,用LSC直接測定得到,將混合溶液的標記量減去富里酸溶液的標記量得到腐殖酸中的標記物含量;胡敏素中的標記量用生物氧化燃燒儀(OX-500; Zinsser Analytic,德國)在900℃下完全氧化4min,用15mL的堿性放射性測定閃爍液(Oxysolve C-400; Zinsser Analytic,德國)收集氧化后的氣體,LSC測定標記量,得到胡敏素中的標記物含量.

1.4 土壤DNA的提取及高通量測序

用FastDNA? SPIN Kit for Soils試劑盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA),提取土壤中總DNA,具體操作步驟詳見試劑盒說明書,用80μL無菌水洗脫并用NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)測定DNA的濃度,提取完成后-20 ℃保存.

Illumina Miseq高通量測序分析細菌群落:細菌16S rRNA擴增引物為519F/907R(CAGCMGCCG- CGGTAATWC/CCGTCAATTCMTTTRAGTTT),每個樣品的上游引物序列中包含有5bp的特異標簽序列(Barcode)用于區分不同樣品.PCR擴增條件為:① 95℃ 5min,② 95℃ 45s,③ 57℃ 45s,④ 72℃ 1min(第2步到第4步35個循環),⑤72℃ 7min.擴增完成后,以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目標產物,PCR產物用Cycle Pure Kit (Omega, Georgia, USA)進行純化并測定濃度,純化步驟參見試劑盒說明書.取相同質量各樣品的PCR產物進行混合,使混合樣品的DNA的總濃度達100ng.TruSeqTMDNA Sample Prep LT Kit和MiSeq Reagent Kit進行Illumina上機測序前的預處理.

1.5 高通量測序結果分析

高通量測序得到的原始數據使用Quantitative Insights into Microbial Ecology 1.9.0(QIIME 1.9.0)進行序列比對及聚類.將序列按barcode進行分組,根據序列質量(質量評分>25,長度>200bp)篩選樣品生成聚類單元(OTU).相似度高于97%的序列歸為相同的OTU,并從每個OTU中挑選代表序列與SILVA119數據庫進行比對歸類,得到OTU的分類信息.為減少細菌共生網絡的復雜程度,僅將相對豐度大于0.1%的OTU用于網絡分析,選擇相關性||>97%且顯著性<0.05的數值進行共生網絡的構建.

1.6 數據處理

細菌群落非度量多維尺度分析(NMDS)用R軟件中的vegan包進行計算,使用Bray-Curtis距離.用Gephi軟件繪制細菌共生網絡并計算特征參數,數據統計分析用SPSS 20.0進行計算,并使用Duncan檢驗進行多重比較(<0.05),OriginPro 2016畫圖.

2 結果與分析

2.1 14C可提取態的變化

用LSC法測定土壤可提取態、結合態、CO2等不同組分中14C標記物的含量,在微宇宙培養及提取過程中14C的回收率為86.5%～106.3%.經過3個月的培養,在各處理中,BaA中的14C主要以可提取態的形式殘留在土壤中(53.8%～60.5%)(圖1).對照中BaA的可提殘留率最高,為60.5%,加入菲、蒽及芘作為共代謝底物時,土壤中可提取態BaA較對照降低,分別降低了6.7%、4.1%、5.7%,說明菲、蒽、芘均可以提高BaA的去除效率.

圖1 二氯甲烷可提取態14C含量

小寫字母表示各組間的差異顯著性;菲表示BaA的共代謝底物為菲,蒽表示BaA的共代謝底物為蒽,芘表示BaA共代謝底物為芘,下同

2.2 BaA礦化率及在土壤有機質組分間的分配

除了可提取態之外,污染物在土壤中的去向還包括礦化生成CO2及有機質結合態(胡敏酸、富里酸、胡敏素).結果顯示,減少的BaA大部分結合進入了土壤有機質,具體分布為:胡敏酸中的結合量為3.8%～5.1%,富里酸中的結合量為2.3%～2.7%,胡敏素中的14C結合量最高,達27.1%～31.7%,而礦化生成CO2的比例只占14C總量的5.4%～7.9%,遠低于土壤有機質中的結合量,說明在共代謝作用下土壤結合態降低污染物生物有效性仍是BaA主要的解毒機制,共代謝作用對污染物土壤分配過程的影響有限.由于污染物結合量與有機質正相關,而胡敏素是有機質中含量最高的組分[10],因此胡敏素成為PAHs土壤結合態的主要去向.

圖2 BaA的礦化率及在土壤有機質中的分配

小寫字母表示各組間的差異顯著性

加入菲、蒽、芘底物后均可以促進BaA礦化生成CO2(圖2),其中蒽作為共代謝底物時,BaA礦化率最高(7.9 % ± 0.3%),比對照(5.4% ± 0.3%)提高了2.5%,蒽能夠提高微生物對BaA及其中間產物的分解及代謝能力;菲、芘作為共代謝底物時,BaA的礦化率無顯著差異,分別為5.9% ± 0.1%及6.7% ± 0.5%,高于對照但不及添加蒽作底物后BaA的礦化率.

在土壤有機質分配中,共代謝能夠促進BaA轉化進入胡敏酸,菲、蒽、芘作為共代謝底物時,14C在胡敏酸中的結合量分別為5.1% ± 0.5%、4.6% ± 0.05%、4.0% ± 0.7%,比對照(3.8% ± 0.5%)有所升高;共代謝底物對BaA富里酸結合態的影響不大,各處理之間無顯著差異;而3種共代謝底物對污染物在胡敏素結合態的影響存在顯著差異:與對照(27.1%)相比,蒽對14C在胡敏素結合態影響不大(27.7%);菲與芘則促進14C在胡敏素中的結合,污染物的結合量均升高至31%,比對照提高了約4%.菲與芘對14C結合量相當.由此可見,蒽對BaA的共代謝作用主要是促進其礦化,菲、芘共代謝作用則主要增強BaA在土壤胡敏素組分中的結合,不同PAHs共代謝對BaA環境分配存在差異.

2.3 土壤細菌群落的變化

高通量測序結果用Silva 119數據庫比對后發現,細菌群落主要由酸桿菌門(Acidobacteria, 22%)、放線菌門(Actinobacteria, 9%),α-變形菌門(Alphaproteobacteria, 15%)、β-變形菌門(Betaproteobacteria, 12%)組成.各處理之間群落組成與分異不明顯(圖3a, 3b),多樣性也無統計學差異(圖3c),說明少量共代謝PAHs對土壤中的微生物群落結構的影響較小.

圖3 土壤中細菌群落組成及多樣性

a:細菌群落組成; b:非度量多尺度分析; c:香農指數; 圖c中小寫字母a表示各組間無顯著差異

2.4 細菌群落共生網絡

表2 細菌共生網絡特征參數

通過分析細菌共生網絡,進一步研究細菌物種之間的相互聯系.結果顯示盡管菲、蒽等共代謝底物對土壤細菌組成及群落影響較小,卻能改變土壤細菌共生網絡結構(表2).相較于對照組,蒽作為共代謝底物時,物種間的正相關連接比例顯著升高(73%),并占主導地位,而網絡中的節點數(112)、連接數(325)、網絡密度(0.052)及負相關連接比例(27%)則明顯下降,提示在蒽共代謝作用下,土壤中微生物之間的共生關系增強[15],共生網絡變得簡單;相反地,添加菲與芘參與代謝時,網絡中的節點數(136～139)、連接數(737～731)、網絡密度(0.077～ 0.08)等參數均比對照有所增加,共生網絡更加復雜,而負連接比例有所升高,說明微生物的競爭關系可能變得激烈.

2.5 關鍵物種分析

在細菌共生網絡中,通常以度(Degree)及中心性(Betweenness centrality)來指示關鍵物種[20],在對照中,網絡中主要的關鍵節點包括放線菌門(Actinobacteria),變形菌門(Proteobacteria),添加共代謝底物后,網絡中的關鍵節點以變形菌門細菌為主(圖4).具體到物種而言,Variibactersp.(變形菌門)在共代謝作用中與其他物種的聯系最密切,提示其在網絡中發揮了重要的作用. Burkholderiales, Xanthobacteraceae等分類下的部分細菌在蒽/菲等共代謝作用下成為關鍵物種(表3),常見的PAHs降解菌株許多屬于這些菌屬中,推測這些細菌可能與PAHs降解相關.當然,目前的結論都是基于統計學的推理,對于實際參與PAHs降解的微生物,還需要結合其它手段進行深入研究,如穩定性同位素示蹤DNA-SIP、PLFA-SIP等方法.

圖4 細菌關鍵物種分析

a: 對照; b: BaA共代謝底物為菲; c: BaA共代謝底物為蒽; d:BaA共代謝底物為芘

表3 關鍵微生物信息

3 討論

3.1 PAHs共代謝底物結構影響BaA環境歸趨

共代謝主要是通過底物刺激微生物中相關酶或輔助因子,提高對污染物的轉化能力.盡管一般利用低分子量PAHs作為共代謝底物促進高分子量PAHs降解[7],但是芘作為一種高分子量的PAHs,同樣可以增強BaA的去除.除此之外,木質素作為一種生物大分子聚合物,也是PAHs降解的共代謝底物之一[3],底物結構或是影響共代謝作用的主要因素.

不同共代謝底物對BaA環境歸趨的影響存在差異:蒽主要促進了BaA的礦化,而菲、芘提高污染物在土壤有機質中的結合.PAHs在土壤中的代謝途徑及相關的功能酶類多樣[11],然而BaA與蒽可能存在相似的代謝途徑:BaA的代謝產物包括1,2-二羥基蒽、1-羥基-2-羧基蒽等[12],而蒽降解也可能產生1,2-二羥基蒽等中間產物[13],因此蒽降解過程中產生酶類,無論是特異性的還是非特異性的,或都可以直接代謝BaA中間產物,從而增強了BaA的礦化;菲、芘的代謝過程則與BaA差異較大[14],降解菲、芘過程中產生的功能酶或細菌對BaA及其相關中間產物的特異性可能不足,因此BaA轉化為極性產物后難以繼續分解,而生成結合態殘留在土壤中.推測當底物與污染物結構相似性高時可能更易促進污染物的礦化;而結構相似性低時則主要促進污染物的土壤結合.

3.2 PAHs共代謝改變土壤細菌的共生網絡

添加少量PAHs共代謝底物對土壤中微生物群落的影響較小,各處理中細菌群落組成、結構以及多樣性均無顯著差異.可能一方面由于實驗中的共代謝底物菲、蒽、芘在土壤中的含量(10mg/kg)遠低于BaA(100mg/kg),另一方面菲、蒽、芘降解速度比BaA快,經90d的培養后,底物已完全降解,只有BaA仍殘留在土壤中,因此微生物群落主要受BaA影響,各處理之間細菌群落組成及多樣性的差異較小.

盡管底物對土壤中細菌群落組成的影響較小,但共代謝底物顯著改變了細菌的共生網絡.在共生網絡中,模塊性(modularity)是網絡拓撲結構的一個重要指標,一組緊密聯系的功能基因或微生物形成一個模塊,modularity與功能相關[16].當modularity> 0.4時,網絡呈模塊結構(modular structure);而modularity<0.4時,則屬于隨機性網絡.在本研究中,添加蒽為底物時modularity為0.66顯著高于對照(0.51),提示細菌網絡的功能性增強,而菲與芘作為底物時,兩者modularity類似,分別為0.56與0.58,比對照中也所升高,但細菌共生網絡的模塊化程度不及添加蒽的處理.代謝過程及產物是影響網絡modularity的重要因子[17-18],蒽與BaA可能有相同的代謝產物及相似的代謝途徑,因此微生物物種間的協作、共生關系增加,網絡結構中的modularity顯著升高;而菲、芘雖能促進雙加氧酶等功能基因的富集[19],但菲、芘與BaA代謝途徑的不同或使得網絡的復雜程度升高,菌群之間對底物的競爭變強,而對BaA及其中間產物降解能力不足,或導致菲、芘促進了14C-BaA在土壤結合態的生成.添加共代謝底物后,細菌共生網絡的變化與污染物環境歸趨具有一致性,從結果推測底物結構的差異改變了微生物的協作關系并最終影響污染物在土壤中的分配,底物與污染物結構相似性越高,可能直接促進污染物的礦化.

4 結論

4.1 共代謝底物菲、蒽、芘均可促進BaA的去除,其中蒽主要促進BaA的礦化,菲、芘則增強BaA在土壤有機質中的結合.

4.2 添加蒽作為共代謝底物時,細菌共生網絡的模塊性顯著增強、細菌物種間以共生關系為主;而菲、芘作為共代謝底物時,共生網絡的模塊性比對照升高但不及蒽的作用,細菌物種間競爭變得激烈.

4.3 共代謝底物與PAHs結構相似時可促進污染物的礦化,而底物與PAHs結構不同時降解途徑存在差異,共代謝則促進BaA的土壤結合.

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致謝：本研究中涉及14C同位素示蹤的試驗在南京大學季榮教授實驗室完成,在此感謝季老師及課題組成員的大力支持.

Effect of co-metabolism by polycyclic aromatic hydrocarbon on the microbial degradation of benzo[a]anthracene and its mechanism.

ZHU Qing-he1,2, ZENG Jun1, WU Yu-cheng1, YANG-Jie2, LIN Xian-gui1*

(1.Key Laboratory of Soil Environmental and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China；2.State Environmental Protection Engineering Center for Urban Soil Contamination Control and Remediation, Shanghai Academy of Environmental Sciences, Shanghai 200233, China)., 2022,42(2)：808～814

In this study, the effect of three co-metabolic substrates (phenanthrene, anthracene, pyrene) on environmental distribution of benzo[a]anthracene (BaA) was studied by using14C isotope tracer. High-throughput sequencing and co-occurrence network analysis were used to evaluate bacterial community responses. The results demonstrated that all the three co-metabolic substrates promoted degradation of BaA. The mineralization of BaA increased by 2.5% in the anthracene treatment compared to the control. In the treatments of phenanthrene and pyrene, the bound residue of14C was 4% higher than in the control, amounting to 31% of the total addition. The topological characteristics of bacterial co-occurrence network changed with the supplementation of co-metabolic substrates. Anthracene significantly raised the proportion of positive links, which indicated mutualistic interactions. In contrast, the competition between bacterial taxa was strengthened in the treatments of phenanthrene and pyrene, as evidenced by increased negative links after incubation. It was likely that anthracene and BaA degraded through common metabolic pathways, which caused mutualistic interactions and higher mineralization rate of BaA in the soil microcosms. Overall, co-metabolism could be an important factor influencing the fate of BaA in soil and changing the interaction among bacterial species.

benzo[a]anthracene；environmental fate；cometabolism；bacterial co-occurrence network

X53

A

1000-6923(2022)02-0808-07

朱清禾(1986-),女,江蘇鎮江人,博士,主要從事多環芳烴微生物降解相關研究.發表論文4篇.

2021-06-18

國家重點研發計劃(2019YFC1803700);國家自然科學基金資助項目(41977132);上海市科技人才計劃項目(19XD1434900)

*責任作者, 研究員, xglin@issas.ac.cn