微生物群落對氨脅迫響應的宏基因組學研究

彭 韻,李 蕾,伍 迪,楊屏錦,彭緒亞,王小銘

微生物群落對氨脅迫響應的宏基因組學研究

彭 韻,李 蕾*,伍 迪,楊屏錦,彭緒亞,王小銘

(重慶大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400045)

為探析厭氧消化微生物群落對氨脅迫的響應,在串聯批次實驗中引入氨氮(TAN)脅迫,結合宏基因組學分析,研究了不同TAN濃度下,厭氧消化系統的過程參數、群落結構/組成及其功能基因/代謝途徑的響應.結果顯示,TAN為3000mg/L時,系統性能逐步優化;TAN為6000mg/L時,甲烷產率逐步下降,并伴隨著丙酸、丁酸積累.從群落組成上看,兩個氨氮梯度下,抗性和冗余性保障了水解酸化菌代謝底物的能力.產氫產乙酸和產甲烷方面,低氨氮組兩類功能菌群豐度持續增加,但高氨氮組增加幅度低甚至出現豐度下降,指示該環節可能受到了氨脅迫.進一步分析兩階段的功能基因變化,發現產甲烷和互營乙酸氧化途徑在氨脅迫下表現出抗性和冗余性,但高濃度TAN(6000mg/L)抑制了丁酸和丙酸代謝途徑中關鍵基因和的表達.可見,氨抑制失穩的關鍵環節是產氫產乙酸階段.

餐廚垃圾；厭氧消化；氨抑制；宏基因組學

厭氧消化技術能將有機廢物轉化為沼氣,但是厭氧消化易遭遇過程失穩,其中氨抑制是全規模厭氧消化系統中主要的失穩誘因[1-2].不少研究者探索了氨脅迫下微生物群落結構的響應,早期研究普遍認為水解酸化細菌受氨氮(TAN)的影響較少[3-6];但氨脅迫會強烈抑制產甲烷菌,其中乙酸型產甲烷菌,如,對氨氮尤其敏感,相比之下,混合營養型的耐受性強得多[6-9].氨脅迫會使反應器內的主導甲烷菌由向演替[10-11].也有研究者著重關注氨脅迫對產甲烷代謝途徑的影響,通過同位素檢測發現,與低氨氮反應器以乙酸營養型產甲烷途徑為主不同,高氨脅迫反應器的產甲烷途徑多以互營乙酸氧化(SAO)聯合氫營養型產甲烷途徑(HM)為主[9].但矛盾的是,有些反應器已經是主導,依然在3500mg/L左右的氨氮下就出現失穩[12].更有研究者直接用互營乙酸氧化細菌(SAOB)進行生物強化,卻發現根本無法改善氨抑制現象[13].

由于氨抑制失穩的反應器往往伴隨著丙酸、丁酸等脂肪酸的大量積累[12],研究者逐步意識到產氫產乙酸階段受氨抑制的程度可能甚于產甲烷階段[14-17].如Li等[14]在反應器中塑造氨脅迫環境(TAN 為2500mg/L),并以丙酸為唯一碳源,發現丙酸降解菌(e和)相對豐度減少,導致丙酸積累,但少量丙酸降解產生的乙酸卻可被立即轉化為沼氣.Zhang等[17]直接對比了氨脅迫下,產氫產乙酸菌和產甲烷菌相對豐度的變化,發現產氫產乙酸菌(和)對高濃度氨氮(6000mg/L)非常敏感,連續高氨氮暴露下,其豐度不能恢復并且沒有被具有相似功能的丙酸降解菌代替,相比之下,暴露于高濃度氨氮,乙酸型產甲烷菌出現了主導菌的演替,氫型產甲烷菌表現出抗性,維持了群落產甲烷功能.Peng等[12]開展了長期的餐廚垃圾干式厭氧消化實驗,發現隨著內源氨積累,乙酸在積累一段時間后能夠穩定到一個特定水平,相比之下,丙酸和戊酸卻在乙酸停止積累后呈現更為迅猛的積累,且最終造成了反應器不可逆的抑制.同時,微生物交互分析證實產氫產乙酸菌()與TAN負相關.

目前對氨抑制失穩機理研究中微生物的測定一般采用的是高通量測序技術,這種方法雖然能較為準確地識別出系統中的微生物類別,卻無法分析微生物的功能.因此,對群落功能的描述只能根據其他文獻中報道的親緣關系較為接近的已鑒定物種的功能進行推斷[18],而實際上不同微生物的功能存在極大差異[10],因此該方法準確度有限.宏基因組學技術對環境中的全基因組進行測序,不僅可以全面地分析微生物群落具有的功能及代謝途徑,使得反應器性能、微生物群落結構和功能/代謝特征之間的相關性研究成為可能,還有助于驗證或者解釋通過16S rRNA方法獲得的關于氨脅迫對群落組成的影響機理,以進一步明確氨抑制失穩根源.采用宏基因組學研究氨抑制失穩機理的研究鮮有報道.基于此,本研究開展了串聯批次實驗,基于宏基因組學技術觀察氨脅迫下,微生物群落結構/分類學組成及其功能基因/代謝途徑的響應.本研究的目的是找出氨抑制失穩的關鍵環節,并從功能基因層面解析該環節受到擾動的原因,為解析氨抑制失穩提供參考.

1 材料與方法

1.1 接種物和底物

接種污泥來自實驗室穩定運行的中溫餐廚垃圾厭氧消化器,使用前進行預孵化去氣.接種污泥的pH值、總固體含量(TS)、揮發性固體含量(VS)和TAN分別為7.89±0.2、(2.73±0.26)%、(2.04±0.07)%和(1723.43±166.78)mg/L.為保證底物的均勻性和實驗結果的可靠性,采用根據實際餐廚垃圾性質配制的模化垃圾(濕基質量比,蔬菜:肉:米飯:植物油=35%:8%:50%:7%)為底物,模化垃圾分裝到自封袋內于-18℃冰凍保存.臨用前1d置于4℃冰箱中解凍.模化垃圾的TS、VS分別為(27.70±0.19)%、(27.54±0.14)%;蛋白質及粗脂肪含量分別為(17.21±0.63)%和(23.32±1.88)%;理論甲烷產率為(507.43±7.31)mLCH4/gVS.

1.2 反應器及運行

根據本團隊前期研究,TAN為3000,6000mg/L時反應器性能都會受到擾動,但TAN為3000mg/L的實驗組在連續批次實驗中系統性能可完全恢復,TAN為6000mg/L的實驗組性能則不斷惡化[17],因此,本研究針對這2個濃度進行研究.

共開展3批次實驗.第1批次實驗在總容積1L,有效容積800mL的反應器(R1_3000)內進行.運行至日產氣量小于累計產氣量的1%時停止,繼續孵化至完全不產氣后開展第2批次實驗.第2批次以R1_3000的消化渣作為接種物,R1_3000的消化渣被均分為2份,其中1份消化渣被暴露在原來的TAN濃度下(R2_3000),而另1份則被暴露至6000mg/L的TAN濃度下消化(R2_6000).第2批次實驗中各反應器產氣完成后,以反應器內全部消化渣作為接種物繼續開展第3批次實驗(R3_3000和R3_6000).為了保證各批次反應器中污泥濃度及有效容積的一致性,2、3批次實驗在總容積500mL,有效容積400mL的反應器內開展.

所有反應器均調節接種污泥濃度為5gVSS/L,底物與接種物濃度比設置為1.氨氮以NH4Cl溶液的形式添加,隨后向每個反應器內添加20%(體積比)的營養液[17],并添加蒸餾水達到有效容積.反應器內的初始pH值采用1mol/L的HCl溶液或3mol/L的NaOH溶液調至7.5.向反應器內充5min氮氣,以排空瓶內的氧氣,保證厭氧環境.反應器置于(36±1)℃的恒溫水浴鍋內發酵,每次記錄氣體體積前手動搖晃1min.

在每個批次反應末期,取液體樣品,每次采樣后立即在4℃下以10000r/min的轉速冷凍離心15min,獲得的上清液用于分析理化指標,污泥樣品則保存至-80℃冰箱中,以備進行宏基因組學分析.

1.3 性能參數分析

產生的甲烷通過排NaOH(3mol/L)法進行收集,并換算成標態下(273.15K,101.325kPa)的體積[19]. pH值、TS、VS和TAN采用國家標準方法測定[20].揮發性脂肪酸(VFAs)(乙酸、丙酸、丁酸)用氣相色譜(7890A,Agilent,美國)測定.底物的蛋白質和脂肪含量分別采用凱氏定氮法(KDN-1,上海)和索氏提取法測定[21-22].碳水化合物用差減法計算[12].根據式(1)將獲得的底物組分用于理論甲烷產率計算[23]:

式中:是理論甲烷產率, mLCH4/gVS;是底物中碳水化合物含量, mg/gTS;是底物中蛋白質含量, mg/gTS;是底物中脂肪含量, mg/gTS.

1.4 動力學模型

考慮到餐廚垃圾極易降解,反應器啟動初期底物被快速水解酸化產生大量VFAs,繼而轉化為甲烷,可使反應器出現第1個產氣高峰.而本研究向各反應器中引入了氨氮擾動,氨氮逐步擴散至微生物細胞內,會對其活性產生抑制,由此迅速引發產氣下降甚至停滯;直至微生物適應后,系統才會恢復產氣,慢慢呈現第2個產氣高峰.鑒于此,采用origin 9.3用含有前后兩個產氣高峰和中間產氣平臺的修正的兩級Gompertz模型[24]對各反應器的產氣情況進行模擬.根據模擬結果,各實驗組實際甲烷產率和模擬甲烷產率的RMSE極小,2極高(0.99～1.00),表明該模型模擬效果很好.模型方程見式(2).

式中:Y是最終甲烷產率, mLCH4/gVS;Y1和Y2分別是第1階段和第2階段的甲烷產率, mLCH4/gVS;R1和R2分別是第1階段和第2階段的比產甲烷活性, mLCH4/(gVS·d);1和2分別是第1階段和第2階段的停滯期, d;e為自然對數,等于2.718.

1.5 宏基因組學分析方法

用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒進行樣品DNA抽提.分別利用TBS-380、NanoDrop200、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度、純度和完整性.通過Covaris M220將DNA片段化,篩選約400bp的片段,使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq構建PE文庫.通過上海美吉生物技術有限公司Illumina NovaSeq測序平臺進行宏基因組測序,原始數據已提交至NCBI數據庫(序列號:SRP231897).

每個樣品獲得94440174～123356644條原始序列.利用fastp(v0.20.0)對原始序列進行質控,去除長度小于50bp、平均堿基質量值低于20以及含N堿基的序列,獲得優化序列.使用基于succinct de Bruijn graphs原理的拼接軟件Megahit(v1.1.2)對優化序列進行拼接組裝,在拼接結果中篩選3300bp的重疊群作為最終的組裝結果.使用MetaGene對拼接結果中的重疊群進行基因預測.選擇核酸長度3100bp的基因,并將其翻譯為氨基酸序列.使用CD-HIT(v4.6.1)對所有樣品預測出來的基因序列進行聚類(相似度390%、覆蓋率390%),每類取最長的基因作為代表序列,構建非冗余基因集.使用SOAPaligner(v2.21),分別將每個樣品的高質量序列與非冗余基因集進行比對(相似度395%),統計基因在對應樣品中的豐度信息.基因豐度計算方法為Reads Per Kilobase Million,即每1百萬條序列中,每個基因以1000個堿基為單位,比對上的序列條數.

采用基于bray_curtis距離算法的樣本層級聚類分析計算了微生物樣本之間的相似度.使用Diamond (v0.8.35)將非冗余基因集的氨基酸序列與NR數據庫和KEGG數據庫進行比對(BLAST比對參數設置期望值e-value為1e-5),以獲得物種和功能注釋.為識別在兩樣本組中具有顯著差異的微生物,基于費舍爾精確檢驗和fdr多重檢驗校正對兩樣本進行了組間差異檢驗,設置值為0.05.

2 結果與討論

2.1 氨氮對反應器性能的影響

從表1可知,第1批次實驗中,氨氮濃度為3000mg/L時,甲烷回收率(實際甲烷產率/理論甲烷產率)僅88.25%,這顯著低于批次實驗條件下穩定運行反應器的甲烷回收率(通常在94%以上[25-26]),也顯著低于本團隊前期研究[17]中報道的本底氨氮濃度(1800mg/L)下反應器的甲烷回收率(96.53%±2.66%).可見R1_3000產氣性能受到了氨氮的影響.當將R1_3000中污泥繼續暴露在3000mg/L的TAN濃度下時,R2_3000的甲烷產率和R2都顯著增加(< 0.05),同時乙酸、丙酸濃度顯著下降(<0.05),丙酸甚至降至0mg/L,表明其性能在連續的暴露中逐漸恢復了.R2_3000較長的2可能代表此階段微生物正在重組適應新環境[27-28].繼續暴露于相同氨氮濃度,R3_3000甲烷產率保持穩定,R2也維持在較高水平,2及乙酸含量進一步下降.說明此氨氮脅迫下,微生物代謝功能已恢復并維持到穩定狀態,系統運行良好.Tian等[29]也觀察到TAN為3300～3800mg/L時, 中溫厭氧反應器運行穩定的現象.

注:*各類酸濃度是指實驗末期酸的濃度.

當將來自R1_3000的種泥暴露于6000mg/L時,R2_6000組反應器的2顯著增加(<0.05),指示微生物也發生了重組;R2顯著提高,甲烷產率也呈現輕微上浮,暗示產氣性能似乎在優化.但同時,反應器末期出現了更大量的VFAs積累,特別是丙酸,高達(428.36±56.79)mg/L.繼續暴露于6000mg/L時, R3_6000組反應器的R2下降,甲烷產率不僅顯著低于R2_6000組反應器(<0.05),也顯著低于R1_3000組反應器(<0.05).VFAs方面,乙酸含量繼續下降,但丙酸積累卻沒有絲毫改善(>0.05),丁酸盡管積累程度不如丙酸,但也呈現持續積累趨勢.這是可以理解的,因為從熱力學角度來看,在標況下(即101325Pa, 298.15K以及反應濃度為1mol/L時),丁酸和丙酸氧化反應的標準吉布斯自由能分別為48.4, 76.2kJ[30],兩者的氧化均無法自發進行,但與丁酸相比,丙酸氧化反應需要吸收的能量更多,因此更難降解.前期在其他擾動因素造成的過程失穩中,丙酸和丁酸也曾被鑒定為主要的過程失穩原因[15,31-32].綜上,TAN為6000mg/L時,乙酸沒有明顯積累,指示其代謝未受阻遏,但丙酸、丁酸在連續暴露實驗中積累,因此它們的代謝可能是造成系統失穩的關鍵.

2.2 氨氮對微生物群落組成的影響

由表2可見,來自同一接種源的微生物樣品暴露于不同TAN后,群落出現了越來越明顯的差異;但同一TAN下,不同批次樣品的群落相似性指數逐步增大,這與前期通過16S rRNA分析方法得到的研究結果一致[17,33].來自同一接種源(R1_3000組反應器)的R2_3000和R2_6000組微生物樣品的群落相似性為88.53%,繼續暴露在對應氨氮濃度下, R3_3000和R3_6000組樣品相似性指數下降至83.77%.表明不同TAN濃度使群落朝著不同的方向演替.相比之下,R1_3000與R2_3000的相似性僅78.23%,這與R2_3000反應器較長的2是對應的.但R2_3000與R3_3000的群落相似性達到86.94%,暗示群落在朝著相同的方向演替.TAN為6000mg/L的實驗組也有群落相似性逐漸增大的規律,R2_6000與R3_6000的群落相似性達到90.31%,表明長期暴露會使微生物的動態演替趨于平衡.通過解析此反應器的群落演替來揭示氨抑制失穩機理是可行的.

采用組間差異檢驗找出了不同氨氮濃度下,各反應器末期具有顯著差異的微生物,并將其按功能分為水解酸化菌、產氫產乙酸菌和產甲烷菌.如圖1a可見,不同氨氮濃度下,相對豐度具有顯著差異的水解酸化菌共檢測到12種.其中,7種微生物在R3_6000中顯著富集(<0.05),5種微生物相對豐度在R3_6000中顯著少于R3_3000(<0.05).總體上, TAN為3000mg/L時,主導水解酸化菌有10種,總相對豐度為28.94%;TAN為6000mg/L時,主導水解酸化菌有11種,總相對豐度為33.11%.多樣性和高豐度保障了水解酸化菌在氨脅迫下代謝底物的能力,因此水解產酸階段并非導致氨抑制反應器失穩的關鍵,這與以前的研究結論一致[17,34].

如圖1b可見,在2個氨氮濃度下相對豐度具有顯著差異的產氫產乙酸菌包括、、、、.據報道,主要降解C4～C18的脂肪酸[17],與R1_3000相比,該菌相對豐度在R2_3000增加了1.02倍,在R3_3000繼續增加,相對豐度達到R1_3000的3.11倍,但在高氨氮濃度下,盡管R2_ 6000和R3_6000都出現明顯的丁酸積累(表1),但相對豐度遠低于低氨氮組(R2_3000和R3_3000),暗示系統丁酸代謝功能可能受到了高氨氮的影響.Du等[35]也指出由于丁酸降解過程發生在熱力學平衡附近,微小的環境變化(如中間化合物)都會導致生物代謝途徑受到影響.除以外的菌都是丙酸降解菌[36-37],低氨氮反應器中丙酸降解菌總相對豐度在R2_3000有所下降,在R3_3000出現回彈,反應末期無丙酸積累;但當TAN為6000mg/L時,盡管兩個實驗組的丙酸降解菌總相對豐度與R1_3000相比僅略有下降,但系統內丙酸積累到131.70～472.90mg/L,暗示該階段代謝功能可能受到擾動.這些結果表明,微生物群落能夠抵抗或成功適應低濃度TAN(3000mg/L),但可能無法在高濃度TAN(6000mg/L)下維持丁酸、丙酸互營氧化功能,丁酸、丙酸的互營降解可能是氨脅迫下反應器性能惡化的關鍵環節.

表2 不同樣本之間的相似性指數

不同氨氮濃度下相對豐度具有顯著差異的產甲烷菌僅有氫營養型和混合營養型.但鑒于檢測到的主導甲烷菌僅3種,乙酸營養型也列于圖1c中.從演替趨勢來看,2個氨氮濃度下,除外,和相對豐度都較R1_3000顯著上升(<0.05),導致R3_3000和R3_ 6000總產甲烷菌相對豐度分別增加了89.18%和33.64%.說明兩個氨氮濃度下,產甲烷菌都得到了富集.而高氨氮反應器中產甲烷菌相對豐度的增加幅度不如低氨氮反應器,除氨氮脅迫外,也可能是產甲烷菌底物受限造成的.雖然2個氨氮濃度下,相對豐度均顯著下降(<0.05),但研究報道,隨著氨水平增加,當受到抑制后,可代替進行乙酸型產甲烷[17,38],因此的富集也許可以代行乙酸型產甲烷功能.而耐受性強的則維持了群落氫型產甲烷功能[39].因此,產甲烷階段不一定是氨抑制失穩的關鍵環節.

2.3 氨氮對微生物代謝途徑的影響

分析產氫產乙酸和產甲烷階段功能基因的響應,而由于本研究及前期研究普遍認為水解酸化階段不是導致氨抑制失穩的關鍵[3],本研究未關注此階段.

2.3.1 產氫產乙酸階段 水解酸化產物,如丙酸、丁酸等,不能直接被產甲烷菌利用,而要先被產氫產乙酸菌轉化為乙酸和H2,再分別被乙酸型和氫型產甲烷菌降解.產氫產乙酸階段包括丁酸及更長鏈脂肪酸的氧化、丙酸互營氧化和SAO.其中,丁酸及更長鏈脂肪酸主要通過β氧化途徑降解,根據KEGG數據庫和本研究檢測到的基因,簡化脂肪酸β氧化途徑如圖2a,脂肪酸β氧化產乙酸的過程就是脂肪酸的羧基在細胞質基質中與輔酶A結合,生成酰基輔酶A,并循環往復地被催化脫去乙基,直至生成乙酰輔酶A,乙酰輔酶A通過三羧酸循環生成乙酸.

圖2b展示了β氧化途徑相關基因的豐度變化,通過對樣本進行差異檢驗,發現3個基因的相對豐度在不同氨氮濃度下具有顯著差異,分別是烯酰輔酶A水合酶編碼基因()、乙酰輔酶A酰基轉移酶編碼基因()和丁酰輔酶A脫氫酶編碼基因().其中,和均在TAN為3000mg/L時得到顯著富集,在TAN為6000mg/L時其相對豐度則維持在R1_3000水平,說明這2個基因氨耐受性強,但低氨氮環境更有助于它們的高度表達,這可能是TAN為3000mg/L的反應器中微生物群落丁酸氧化功能更優,系統性能得以恢復的原因之一.丁酸的互營氧化過程中,關鍵步驟是丁酰輔酶A的氧化,涉及到酰基輔酶A氧化酶編碼基因()//酰基輔酶A脫氫酶編碼基因(),在低氨氮環境中顯著上調(< 0.05),而在高氨氮環境中受到嚴重抑制(<0.05),導致負責丁酰輔酶A氧化的基因總相對豐度下降了46.78%.由此可見,丁酸互營氧化途徑確實受到了高濃度氨氮的影響,證實了2.1節的推論.

圖2 脂肪酸β氧化途徑及相關基因豐度變化

丙酸互營氧化途徑主要為甲基丙二酰輔酶A途徑(MMC途徑).如圖3a所示,丙酸首先被活化為丙酰輔酶A,然后通過MMC途徑進行互營降解,轉化為琥珀酰輔酶A后進入三羧酸循環,被進一步氧化為乙酸.對于丙酸活化過程,由圖3b可知,丙酸輔酶A轉移酶編碼基因()和乙酸輔酶A連接酶編碼基因()在2個氨氮濃度下都保持穩定.磷酸乙酰轉移酶編碼基因()在TAN為3000mg/L時受到抑制作用,與Yu等[27]的研究結果類似.催化輔酶A和CH3-CO-Pi生成Acetyl-CoA,CH3-CO-Pi可以可溶性CH3-CO-PO4K2、CH3-CO-PO4Na2及其他金屬離子的形式存在.在產甲烷菌的胞內結構中,大多數金屬離子會不受控的富集,同時氨分子向細胞壁擴散的可控性較差,也會因質子泵而在胞內結構中積累,2者反應生成CH3-CO-PO4[NH4]2,預期轉化率超過90%,且反應產物為不溶性沉淀[27].而根據研究報道,氨氮對的抑制率可達95.57%[27].因此,CH3- CO-Pi更多的被用于與氨分子反應轉化為CH3- CO-PO4[NH4]2沉積物,由于底物缺乏,丙酸通過丙酰磷酸生成丙酰輔酶A路徑受到抑制.但是乙酰輔酶A合成酶編碼基因()相對豐度在R3_3000開始上升,增長率為8.91%,丙酸活化過程代謝途徑的轉變,有助于維持丙酸活化功能.Yu等[27]運行了5組TAN濃度不等(171.17～3043.83mg/L)的實驗室規模的反應器,也發現了丙酸活化途徑從生成丙酰磷酸轉變為生成丙酰腺苷酸.相比之下,TAN為6000mg/L時,相對豐度并無顯著變化(>0.05),但在兩批次氨氮暴露過程中,相對豐度持續下降,較R1_3000下降約24.28%,在一定程度上影響了丙酸活化功能.

對于MMC途徑,丙酰輔酶A羧化酶α鏈編碼基因()與類似,在R2_3000和R2_6000中豐度均顯著下降(<0.05),但持續暴露在低氨氮環境中,該基因相對豐度開始上調,增長率為17.45%,而在高氨氮環境中,該基因的受抑制情況毫無改善, 其在R3_6000組樣品中的相對豐度較R1_3000組少54.73%.相比之下,連續暴露下甲基丙二酰輔酶A編碼基因()和甲基丙二酰輔酶A變位酶編碼基因()的相對豐度也有所下降,但其在兩個氨氮濃度下(R2_3000和R2_6000、R3_3000和R3_6000)并沒有顯著差異(>0.05),因此它們可能不是氨抑制失穩的關鍵基因.

圖3 MMC途徑及相關基因豐度變化

由此可見,MMC途徑的關鍵基因受到不可逆抑制是高氨氮環境丙酸大量積累的主要原因,進一步證實了丙酸互營氧化過程是反應器失穩的根源.

SAO是產氫產乙酸階段中的特殊環節,該環節在乙酸代謝受阻時,發揮重要作用[39],將乙酸轉化為H2和CO2進而被氫型產甲烷菌代謝.大多數已鑒定的SAOB都是通過反向Wood-Ljungdahl途徑(WL途徑)進行乙酸氧化[40].反向WL途徑由2個分支組成,甲基分支和羧基分支.在甲基分支中,乙酰輔酶A被氧化為甲基進而氧化為CO2,而在羧基分支中,乙酰輔酶A被氧化為CO進而氧化為CO2(圖4a).

圖4 WL途徑及相關基因豐度變化

如圖4b所示,TAN為3000mg/L時,甲基分支中亞甲基四氫葉酸還原酶編碼基因()、四氫葉酸連接酶編碼基因()的表達受到抑制,但羧基分支相關基因均得到富集,總相對豐度上調約11.76%,維持了群落互營乙酸氧化功能;TAN為6000mg/L時,羧基分支部分一氧化碳脫氫酶編碼基因()的表達受到抑制,但甲基分支中、亞甲基四氫葉酸脫氫酶編碼基因()得到富集,有助于維持群落互營乙酸氧化功能,從而避免了系統乙酸的積累,與Ruiz-Sánchez等[41]的研究結果一致.由此可見,此環節并不是氨抑制失穩的關鍵環節.很多研究都指出反應器受到氨擾動后,除了乙酸型產甲烷途徑,乙酸還會通過SAO-HM產甲烷[30,39],氫和還原力通過SAO途徑得到釋放,是厭氧微生物應對氨氮抑制的重要適應性機制[32].此外,雖然SAO代謝途徑沒有受損,但本研究卻沒有檢測到常見的SAOB,推測系統中可能存在未知的SAOB,后續可結合宏轉錄組學和宏蛋白質組學技術進一步驗證.

2.3.2 產甲烷階段 厭氧消化的最后1個階段是產甲烷,根據底物類型的不同,產甲烷途徑包括:乙酸型產甲烷(M00357)、還原CO2型產甲烷(M00567)、甲醇型產甲烷(M00356)以及甲胺型產甲烷(M00563)4種[42].

圖5 產甲烷途徑及相關基因豐度變化

根據KEGG數據庫,對于M00357,乙酸通過兩種機制轉變為乙酰輔酶A,其一是乙酸經乙酸激酶和磷酸乙酰轉移酶的催化利用1分子ATP轉變為乙酰輔酶A,主要采用這種機制;另一種是乙酸通過乙酰輔酶A合成酶和2分子ATP被轉化為乙酰輔酶A,代表微生物是[42].乙酰輔酶A再分別由乙酰輔酶A羧化酶、四氫甲蝶呤S-甲基轉移酶催化生成甲基輔酶M.對于M00567,甲酰甲烷呋喃脫氫酶催化還原CO2為甲酰基共價連接于甲烷呋喃的氨基基團形成甲酰甲烷呋喃,接下來甲酰甲烷呋喃在四氫甲烷蝶呤甲酰轉移酶、甲酰四氫甲烷蝶呤環化水解酶等酶的催化下形成甲基輔酶M[42].M00356和M00563都屬于甲基營養途徑,甲基化合物在特殊的輔酶M甲基轉移酶系統作用下將甲基基團轉移到HS-CoM的巰基上生成甲基輔酶M[42].4個途徑都包括的共有部分為甲基輔酶M轉化為甲烷及輔酶M-S-S-輔酶B轉化為輔酶B兩步.

4條完整途徑都在本研究中被檢測到,由圖5可見,R3_3000中4條途徑相關基因相對豐度之和均大于R3_6000,盡管R3_3000產甲烷代謝功能整體優于R3_6000,但是從基因相對豐度的變化來看,4條產甲烷代謝途徑都表現出對氨的極強抗性,尤其是甲基型產甲烷途徑和共有代謝途徑在兩個氨氮濃度下均被顯著富集,說明氨氮并沒有抑制群落產甲烷功能.具體來看,甲基型產甲烷途徑所獨有的基因和4條途徑共有的基因在氨氮的刺激下均顯著上調(<0.05),其中,四氫甲烷蝶呤S-甲基轉移酶編碼基因()的富集有助于增強魯棒性[43],解釋了物種分析中的顯著富集現象.氫型產甲烷途徑所獨有的基因在不同批次的馴化下均保持穩定,SAO途徑可為氫型產甲烷途徑提供電子和碳源[27],結合SAO途徑的穩定再次暗示了系統中可能存在未知SAOB.對于乙酸型產甲烷途徑所獨有的基因,高氨氮環境中,被強烈抑制(>0.05),但乙酸激酶編碼基因()和均保持穩定,如前所述,主要采用前者進行產甲烷,主要采用后者進行產甲烷,結合物種分析中和相對豐度的變化,有效證明了本研究中代替維持了乙酸型產甲烷的推論.

另一方面,丙酸和丁酸代謝需要丙酸互營氧化功能、丁酸互營氧化功能和耗氫的CO2還原型產甲烷功能共同作用,CO2還原途徑是厭氧消化過程中電子流動的關鍵,氫型產甲烷菌通過該途徑降解低濃度H2/甲酸鹽,有助于推動產氫產乙酸階段的順利進行[44],后者基因功能的穩定也說明失穩狀態下,丙酸、丁酸代謝受阻僅歸因于前端丙酸、丁酸互營氧化過程被氨氮抑制.總之,群落產甲烷功能并不是氨抑制失穩的根本原因.

3 結論

3.1 氨氮影響厭氧消化系統性能和產氣動力學. TAN為3000mg/L時,長期暴露可使厭氧消化系統性能優化;TAN為6000mg/L時,長期暴露無法恢復系統的性能.

3.2 多樣性和高豐度保障了水解酸化菌在氨脅迫下代謝底物的能力,水解酸化階段不是系統運行失敗的原因.

3.3 高氨氮環境中,甲基型產甲烷途徑相關基因被富集,氫型產甲烷途徑相關基因保持穩定,乙酸型產甲烷途徑由經乙酰輔酶A合成酶催化直接生成乙酰輔酶A轉變為由乙酸激酶和磷酸乙酰轉移酶聯合催化生成乙酰輔酶A,維持了群落乙酸型產甲烷功能.因此產甲烷代謝途徑對氨的極強抗性及其本身的代謝冗余性,也保障了群落產甲烷功能.

3.4 產氫產乙酸階段中,高氨氮抑制了關鍵基因和的表達,影響了群落互營丁酸和丙酸氧化功能,由此引起高氨氮反應器中丁酸和丙酸的積累,反應器產氣性能下降.鑒于此,互營丁酸和丙酸氧化是高氨氮反應器過程失穩的關鍵環節.

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Metagenomic analysis on the responses of microbial community to ammonia stress.

PENG Yun, LI Lei*, WU Di, YANG Ping-jin, PENG Xu-ya, WANG Xiao-ming

(Key Laboratory of Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China)., 2022,42(2)：777～786

A series of batch experiments were conducted to investigate the responses of anaerobic digestion (AD) microbial community exposed to ammonia (TAN) stress. In combination with Metagenomic sequencing analysis, this paper investigated the responses of process parameters, community structure/composition and functional gene/metabolic pathways of AD to the process disturbance induced by different TAN concentrations. The overall performance of AD system was gradually optimized at the concentration of 3000mg/L TAN while when TAN reached 6000mg/L, an accumulation of propionate and butyrate was observed with a concomitant decrease of methane yield. At both concentration levels, the resistance and redundancy of hydrolytic and acidogenic bacteria can ensure their metabolic performance for substrate degradation. However, the total relative abundance of acetogens and methanogens at the low concentration level continued to increase, whereas a low increase rate and even a decrease in the total relative abundance was observed at the high level, suggesting the potential process inhibition. By further analyzing the functional gene changes in the two process stages, The methanogenesis and syntrophic acetate oxidation pathways showed resistance and redundancy under the ammonia stress, but the high concentration of TAN (6000mg/L) inhibited the expression of key genesandin the syntrophic degradation of butyrate and propionate. Therefore, the key contributor to the ammonia inhibition turned out to be acetogenesis.

food waste；anaerobic digestion；ammonia stress；metagenomics

X705

A

1000-6923(2022)02-0777-10

彭 韻,(1993-),女,重慶人,重慶大學博士研究生,研究方向為固體廢物污染控制與資源化.發表論文5篇.

2021-06-22

國家自然科學基金資助項目(51708057);重慶市自然科學基金資助項目(cstc2018jcyjAX0743)

* 責任作者, 副教授, lileich17@cqu.edu.cn