響應面優化超聲輔助酶法提取辣椒紅色素研究

韓世明，方玉梅，吳蓮蓮，陸康寧

(六盤水師范學院 生物科學與技術學院，貴州 六盤水 553004)

辣椒紅色素是在成熟辣椒中提取的一種天然的紅色素[1]。辣椒紅色素不僅具有色價較高、著色力強、保色效果好[2]等優點，還具有良好的抗輻射、抗腫瘤等功效[3]，因此，辣椒紅色素的使用較為普遍，不僅適用于海鮮、肉類、飲料等食物，同時還可以使仿真食品的貨架期大大延長。

從紅辣椒中提取辣椒紅色素的方法主要有油溶法[4-5]、有機溶劑法[6]、超聲波溶劑提取法[7-8]、微波輔助提取法[9]、酶提取法[10]、超臨界CO2流體萃取法等[11]。油溶法提取時，紅色素與油的分離難度較高，提取速率較低，同時產品的色價不高，現在已經基本沒有廠商使用該種方法[12]。用有機溶劑提取后剩余的殘渣中辣椒紅色素的含量較多，成品中的雜質較多，花費的成本較高，純化紅色素也較為昂貴，殘留物的可利用性低，對于工業化生產來說較為困難[13]。超臨界CO2流體萃取法獲得的成品中色素種類較多，操作相較于其他方法較為簡單，而且成品較純，但由于儀器價格高昂、成本較高，小的生產廠商一般無法承擔，因此該方法使用較少。

由于細胞壁的阻攔，辣椒紅色素的溶出速率較低，用纖維素酶破壞植物細胞壁可以加快紅色素的溶出[14]；超聲波的機械作用也可以使內溶物的溶出速度加快[15]。與傳統的油溶法、有機溶劑法相比，超聲輔酶提取法的提取率高、提取時間短、產品純度高、操作工藝簡單、設備維護和保養方便，是一種實現高效、節能、環保式提取的現代高新技術手段[16]。

本研究對超聲輔助酶法提取辣椒紅色素的工藝進行優化，在單因素實驗(酶濃度、超聲功率、超聲時間和超聲溫度)的基礎上，通過響應面分析法對實驗結果進行分析并進行實驗驗證，確定最佳的提取工藝，為辣椒的進一步開發與利用提供了參照。

1 材料與方法

1.1 材料

風干鐵皮椒：購于市場。

1.2 試劑

無水乙醇、丙酮：國藥集團化學試劑有限公司；纖維素酶、果膠酶：南寧龐博生物工程有限公司。

1.3 主要儀器與設備

GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；752N紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；ATY-124電子天平 上海西艾愛電子有限公司；DFT-200高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；SB-800DT超聲波清洗機 浙江寧波新芝生物科技有限公司；SHB-3循環水式真空泵 鄭州杜甫儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 輔助酶的選擇

稱取1 g樣品，置于25 mL的65%乙醇中，分別加入4 mg纖維素酶、4 mg果膠酶、2 mg纖維素酶+2 mg果膠酶，在超聲功率350 W下超聲處理65 min，然后抽濾得濾液，將濾液定容至50 mL，在514 nm處[17]測定吸光度。

1.4.2 單因素實驗

以吸光度值為指標，采用單因素實驗研究酶用量、超聲功率、乙醇濃度、超聲時間對辣椒紅色素提取效果的影響，實驗水平分別選取加酶量1，2，3，4，5，6 mg；乙醇濃度45%、55%、65%、75%、85%、95%；超聲功率210，280，350，420，490，560 W；超聲時間45，55，65，75，85，95 min。對提取條件進行初步優化，確定較佳因素實驗參數范圍，每個處理重復3 次，結果取平均值。

1.4.3 響應面優化實驗

在辣椒紅色素提取的單因素實驗結果基礎上，選擇超聲功率，乙醇濃度、超聲時間、酶用量的4個單因素進行四因素三水平的Box-Benhnken實驗設計，然后用Design-Expert 8.0軟件進行響應面分析，以此得出提取辣椒紅色素的最優條件。

表1 響應面實驗因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface experiment

1.4.4 辣椒紅色素色價的計算

將在最優條件下提取的辣椒紅色素的粗提物在60 ℃烘干至恒重，用丙酮溶解后并測定吸光度值，按照以下公式計算辣椒紅色素色價：

(1)

2 結果與分析

2.1 辣椒紅色素提取的單因素實驗結果

2.1.1 輔助酶的選擇

圖1 不同酶提取辣椒紅色素Fig.1 Extraction of red pigment from Capsicum annuum by different enzymes

由圖1可知，添加4 mg果膠酶的吸光度值和不加任何輔助酶辣椒紅色素的吸光度值相差不大，添加4 mg纖維素酶與添加2 mg纖維素酶+2 mg果膠酶的混合酶辣椒紅色素的吸光度值差值不大，在本次單因素實驗中，果膠酶的作用相當于沒有，所以，在接下來的實驗中只添加纖維素酶。

2.1.2 纖維素酶用量對辣椒紅色素提取的影響

圖2 不同酶用量提取辣椒紅色素Fig.2 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different enzyme additive amount

由于細胞壁的阻攔，辣椒紅色素的溶出速率較低，用纖維素酶破壞植物細胞壁，改變了細胞結構，提高了辣椒紅色素向乙醇擴散的速率，加快了紅色素的提取。由圖2可知，在控制其他條件不變的情況下，根據酶用量不同提取出的辣椒紅色素的吸光度值呈先上升后略微下降的趨勢。其原因是：加酶量低于4 mg時，隨著酶用量的增加，酶與酶的作用物接觸面積在不斷增加，辣椒紅色素的吸光度值也在增加；在酶用量超過4 mg時，吸光度值下降，有可能是因為底物濃度飽和，再繼續添加酶有可能抑制酶的作用。在纖維素酶用量為1～4 mg的范圍內，辣椒紅色素的吸光度值不斷增大，當纖維素酶用量超過4 mg時，其數值開始降低，故選擇纖維素酶用量4 mg為本次實驗的最佳用量。

2.1.3 乙醇濃度對辣椒紅色素提取的影響

圖3 不同濃度的乙醇提取辣椒紅色素Fig.3 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different concentration of ethanol

由圖3可知，當乙醇濃度在45%～75%時，辣椒紅色素的吸光度值隨著乙醇濃度的增加而增加，但當乙醇濃度超過75%時，辣椒紅色素的吸光度值隨著乙醇濃度的增加而略有降低。其原因可能是過高濃度的乙醇大大抑制了酶的作用，導致細胞被破壞的程度降低，減少了辣椒紅色素的滲出量，導致辣椒紅色素的吸光度值降低。由此可見，本次實驗乙醇的最佳提取濃度為75%。

2.1.4 超聲功率對辣椒紅色素提取的影響

圖4 不同超聲功率提取辣椒紅色素Fig.4 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different ultrasonic power

由圖4可知，起初辣椒紅色素的吸光度值與超聲功率成正比，在功率為420 W時，辣椒紅色素的吸光度值達到峰值，之后辣椒紅色素的吸光度值與超聲功率成反比。在峰值之后，辣椒紅色素的吸光度值開始下降，原因可能是辣椒紅色素的組成被超聲波的空化效應破壞。

2.1.5 超聲時間對辣椒紅色素提取的影響

圖5 不同超聲時間提取辣椒紅色素Fig.5 Extraction of red pigment from Capsicum annuum with different ultrasonic time

由圖5可知，起初辣椒紅色素的吸光度值與超聲時間成正比，當超聲時間達到75 min時，辣椒紅色素的吸光度值升到頂峰，之后辣椒紅色素的吸光度值與超聲時間成反比，辣椒紅色素的吸光度值開始下降。辣椒紅色素在超聲波的空化效應等作用下，可以加快其提取速率，但時間過長，辣椒紅色素的組成被破壞，使其變成其他物質，這便使得辣椒紅色素的吸光度值不斷降低。

2.2 響應面法優化實驗設計及結果分析

2.2.1 響應面實驗設計與分析

結合單因素的實驗結果，選擇超聲功率、乙醇濃度、超聲時間和酶用量等因素，以辣椒紅色素的吸光度值為響應值，采用Box-Behnken響應面實驗設計四因素三水平的實驗，響應面實驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

續 表

響應面實驗結果見表2，以辣椒紅色素的吸光度值為指標，利用軟件Design-Expert 8.0對數據進行分析，得到回歸方程為：Y=1.12+0.0353A+0.0048B+0.0098C+0.0008D-0.0058AB+0.0023AC+0.0022AD-0.0060BC+0.0027BD+0.0022CD-0.1620A2-0.0801B2-0.0756C2-0.0665D2。

由表3可知，模型的P值<0.0001，表明回歸模型極顯著，失擬項的P=0.0621>0.05，模型的失擬項不顯著，表明本次實驗的模型合適，本次實驗的實驗數據具有意義。

2.2.2 響應面交互作用分析

根據軟件得到的響應面曲線圖及等高線圖見圖6～圖11，分析超聲功率、乙醇濃度、超聲時間、酶用量4個因素對辣椒紅色素提取的交互作用。

圖6 超聲功率和乙醇濃度對辣椒紅色素提取影響的響應面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and ethanol concentration on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖6可知，等高線接近圓形，表明超聲功率和乙醇濃度的交互作用不強，超聲功率和乙醇濃度的影響不顯著。

圖7 超聲功率和超聲時間對辣椒紅色素提取影響的響應面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖7可知，等高線接近圓形，表明超聲功率和超聲時間的交互作用不強，超聲功率和超聲時間對辣椒紅色素提取的影響不顯著。

圖8 超聲功率和酶用量對辣椒紅色素提取影響的響應面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic power and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖8可知，等高線為橢圓形，表明超聲功率和酶用量的交互作用較強，超聲功率對辣椒紅色素提取的影響較顯著。

圖9 乙醇濃度和超聲時間對辣椒紅色素提取影響的響應面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour diagram of the effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖9可知，等高線為橢圓形，表明乙醇濃度和超聲時間的交互作用較強，超聲時間的影響較顯著。

圖10 乙醇濃度和酶用量對辣椒紅色素提取影響的響應面及等高線圖Fig.10 Response surface and contour diagram of the effect of ethanol concentration and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖10可知，等高線為橢圓形，表明乙醇濃度和酶用量的交互作用較強，酶用量的影響較顯著。

圖11 超聲時間和酶用量對辣椒紅色素提取影響的響應面及等高線圖Fig.11 Response surface and contour diagram of the effect of ultrasonic time and enzyme additive amount on the extraction of red pigment from Capsicum annuum

由圖11可知，等高線為橢圓形，表明超聲時間和酶用量的交互作用較強，超聲時間對辣椒紅色素提取的影響較為顯著。

2.2.3 響應面因素水平優化結果及模型驗證

用響應面分析回歸模型，辣椒紅色素的吸光度值預測最大值時各因素水平為超聲功率435.250 W、乙醇濃度75.470%、超聲時間76.303 min、酶用量4.018 mg，理論上吸光度值為1.125。

為驗證響應面法得到的結果的準確性，將最佳提取條件更改為：超聲功率434 W、乙醇濃度75.5%、超聲時間76.3 min、酶用量4 mg，進行3次重復實驗，測得其吸光度值為1.116，可見實際值與理論值相差較小，說明本次實驗所建模型與實際情況擬合良好，此次實驗所得數據精準可靠，具有一定的實用價值。

2.3 辣椒色價的計算結果

測得的吸光度值為1.237，根據公式計算出辣椒紅色素的色價為103.08。

3 結論

通過單因素及響應面實驗設計法對超聲波輔助酶法提取辣椒紅色素的工藝進行優化研究，采用Box-Behnken實驗設計和響應面分析法，得到超聲波輔助酶法提取辣椒紅色素的最佳條件為超聲功率434 W、超聲時間76.3 min、乙醇濃度75.5%、酶用量4 mg，此條件下，提取出來的辣椒紅色素的吸光度最高。同時，本實驗建立的回歸模型是有效可行的，可以用來預測設定實驗因素條件下辣椒紅色素提取工藝參數的響應值。該研究結果可為辣椒紅色素提取工藝的工業化應用提供參數借鑒。