正交法優化超聲波提取橘皮果膠的工藝研究

李靚，朱涵彬，李長濱，潘春梅，岳曉禹，王夢蝶

(河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院，鄭州 450046)

柑橘作為一種水果，因含有多種營養成分、保健功效良好而深受消費者喜愛。但在柑橘直接食用或加工生產中，產生約20%～50%果皮渣廢棄物，若用物理或化學方法處理，既可得到豐富的糖類、維生素等高營養價值物質，還可得到果膠[1]、精油[2]、色素[3]、黃酮[4]等生物活性物質。橘皮還可應用于低糖型風味果醬的研制[5]，誘導酚類抗氧化活性應用于功能性醬油開發等[6]，在食品、藥品及調味品等行業領域具有廣闊的應用前景。果膠作為食品添加劑被大量使用，若能從橘皮中快速提取優質果膠可將資源最大化利用。因此，研究優化果膠的提取工藝、提高其得率顯得尤為重要。

果膠提取方法主要有酸水解法、酶法、超聲波法及復合法等[7-11]。超聲波能破壞細胞結構，增加細胞壁的通透性，促進果膠游離，使得提取速率加快。酸水解法將不溶性原果膠在酸作用下轉化為水溶性果膠，使得提取產量加大。因此，本文擬采用超聲波輔助酸法提取橘皮果膠，通過正交試驗優化單因素提取條件從而提高果膠得率，為橘皮果膠的研究開發提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川青見柑橘皮：購于鄭州市丹尼斯超市；95%乙醇：新鄉市三偉消毒制劑有限公司；無水乙醇(AR)：萊陽經濟技術開發區精細化工廠；硫酸(AR)：煙臺市雙雙化工有限公司；氫氧化鈉(AR)：西安天茂化工有限公司；0.1 mol/L鹽酸：廣州和為醫藥科技有限公司；咔唑(AR)、半乳糖醛酸試劑(AR)：上海麥克林生化科技有限公司；緩沖溶劑等。

1.2 儀器與設備

FA2104型電子天平 上海力辰科技有限公司；DHG-9140型電熱鼓風干燥機 廣州康恒儀器有限公司；UV-759CRT型分光光度計 上海菁華科技有限公司；RHP-500A型粉碎機 浙江永康市榮浩工貿有限公司；SHZ-C恒溫水浴振蕩器 杭州艾普儀器設備有限公司；3S型超聲波反應器 江蘇江大五棵松科技有限公司；TDZ4-WS型離心機 河南攀之峰科技有限公司；PHS-25型酸度計 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；HH-6型恒溫水浴鍋 常州市萬豐儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 半乳糖醛酸標準曲線的繪制

根據中華人民共和國農業行業標準NY/T 2016-2011對果膠進行定量[12]。

在100 mL容量瓶中加入0.1000 g半乳糖醛酸試劑，加入0.5 mL 40 g/L NaOH溶液定容成濃度為1000 mg/L的溶液。吸取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分別放入25 mL容量瓶中，固定質量濃度為0.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg/L的半乳糖醛酸溶液。

取1 mL不同濃度的半乳糖醛酸溶液放入比色管中，加入0.25 mL咔唑-乙醇溶液，再迅速加入5.0 mL濃硫酸后搖勻，80 ℃恒溫水浴振蕩器振蕩20 min。取出比色管待冷卻，用分光光度計在525 nm處測定不同濃度溶液的吸光度。以半乳糖醛酸溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，經過3次試驗得到擬合度最好的線性方程為y=0.0077x+0.0042，相關系數為R2=0.9989。

1.3.2 操作步驟

將新鮮橘子剝皮后置于沸水中煮5～10 min，使可以分解果膠的酶失活。將煮后的橘皮用60 ℃水反復漂洗后置于80 ℃干燥箱中干燥6 h至恒重，再用粉碎機粉碎成細小粉狀于40目篩過篩即得橘皮粉末以備用。

取一定量粉末加蒸餾水后用0.1 mol/L鹽酸調節，放置于超聲波反應器中控制溫度和時間，取上清液過濾，將95%乙醇倒入濾液中攪拌，將離心機設置在4000 r/min，時間為0.25 h離心，將所得果膠在85 ℃下干燥即得果膠沉淀。將果膠沉淀加入0.5 mL 40 g/L NaOH溶液，定容至100 mL容量瓶中。

1.3.3 結果計算

取1 mL果膠稀釋液按制作標準曲線的方法操作，測定果膠稀釋液的吸光度并記錄結果。根據下式計算果膠提取率A，并保留四位有效數字。

式中：ρ為通過線性方程算出的稀釋液的半乳糖醛酸質量濃度(mg/L)；V為果膠沉淀溶解并定容的體積(mL)；m為樣品的質量(g)。

1.4 單因素試驗條件設計

通過設計單因素試驗，設置變量研究4個影響因素：料液比設置成5個水平(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，pH設置成5個水平(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5)，超聲溫度設置成5個水平(55，60，65，70，75 ℃)，超聲時間設置成5個水平(20，30，40，50，60 min)，探究各因素對橘皮果膠提取率的影響，平行3次試驗取平均值。

1.5 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，以果膠提取率為結果指標，選擇料液比、pH值、超聲溫度和超聲時間為考察因素，選取3個水平，用L9(34)正交表設計試驗，通過超聲波輔助酸法優化橘皮果膠的提取工藝條件，得出果膠最大提取率，再確定最佳工藝條件，見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素與水平設計表

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 最佳料液比的確定

準確稱取5份1 g橘皮粉末，將料液比設定為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)，調整溶液pH值為1.5，在超聲溫度為70 ℃、超聲時間為40 min時取出離心。倒入95%乙醇取得果膠沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。測定幾次取平均值，結果見圖1。

圖1 料液比對果膠提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of pectin

由圖1可知，隨著料液比增大，吸光度呈先上升后下降的趨勢。在料液比為1∶15時，吸光度最大，為0.176，換算式果膠提取率為22.31%。這是由于料液比低于1∶15時，混合液比較黏稠，使得在過濾過程中比較困難，果膠可能濾出不完全，而其他果膠被留在殘渣中難以濾出，從而導致提取率較低。當料液低高于1∶15時，用乙醇沉淀時會導致濾出的果膠濃度較低，使其轉化成果膠的量也會減少。

2.1.2 最佳pH的確定

準確稱取5份1 g橘皮粉末，加鹽酸調整溶液pH值分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，在料液比為1∶15、超聲溫度為70 ℃、超聲時間為40 min時取出離心。倒入95%乙醇取得果膠沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。測定幾次取平均值，結果見圖2。

圖2 pH值對果膠提取率的影響Fig.2 Effect of pH value on the extraction yield of pectin

由圖2可知，隨著溶液pH值的變化，吸光度呈先上升后下降的趨勢。當溶液pH值在1.5時的吸光度比其他水平值高，得到果膠提取率最大，為22.28%。強酸(如鹽酸、硫酸等)使用有利于橘皮中原果膠溶解，但是酸度過低時會導致果膠內部被破壞，從而降低果膠的提取率。

2.1.3 最佳超聲溫度的確定

準確稱取5份1 g橘皮粉末，選擇料液比為1∶15、pH值為1.5時，按超聲溫度為55，60，65，70，75 ℃，超聲時間為40 min取出離心。倒入95%乙醇取得果膠沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。測定幾次取平均值，結果見圖3。

由圖3可知，隨著超聲溫度升高，吸光度呈現先上升后下降的趨勢。當超聲溫度為70 ℃時，吸光度值最大，果膠提取率為22.53%。溫度的升高可加快果膠提取速率，若大于70 ℃，溫度過高，可能會導致果膠分解，反而會使橘皮果膠的提取率下降。

2.1.4 最佳超聲時間的確定

準確稱取5份1 g橘皮粉末，選擇料液比為1∶15、pH為1.5、超聲溫度為70 ℃時，設置超聲時間分別為20，30，40，50，60 min取出離心。倒入95%乙醇取得果膠沉淀，溶解于0.5 mL 40 g/L NaOH溶液后定容。測定幾次取平均值，結果見圖4。

圖4 超聲時間對果膠提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of pectin

由圖4可知，隨著超聲時間增加，吸光度呈先上升后下降的趨勢。在超聲時間為40 min時，吸光度值最大，果膠提取率為22.38%。當超聲時間在20～40 min，由于超聲時間過短，使果膠不能充分地溶解到溶劑中；當超聲時間大于40 min時，果膠分子結構在長時間作用下發生分解變性使果膠提取率降低。因此，要控制好超聲時間，防止果膠發生降解。

2.2 正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，進行L9(34)正交試驗，試驗結果見表2。

表2 L9(34)正交試驗方案及結果分析表

由表2中極差R值大小可知，B(pH)對果膠得率的影響最大，A(料液比)對果膠得率的影響最小。因素影響效果由大到小為：B(pH)>C(超聲溫度)>D(超聲時間)>A(料液比)。

又由于A列中K2>K1>K3；B列中K2>K1>K3；C列中K2>K3>K1；D列中K2>K3>K1。因此，經正交試驗獲得的最優方案為B2C2D2A2，即在超聲溫度70 ℃、pH 1.5、超聲時間40 min、料液比1∶15的條件下獲得較多的果膠。

表3 方差分析表

由表3可知，P<0.05說明具有顯著性，P<0.01說明非常具有顯著性，因此料液比對果膠提取率具有顯著性影響，而pH、超聲溫度和超聲時間對果膠提取率具有非常顯著性影響。

2.3 驗證試驗

在正交試驗中得到的最優方案為B2C2D2A2，即工藝條件：料液比為1∶15，pH值為1.5，超聲溫度為70 ℃，超聲時間為40 min。以最優方案B2C2D2A2進行3次平行試驗，橘皮果膠提取率分別為22.42%、22.33%、22.54%，平均的提取率為22.43%。由于這3次結果均大于正交試驗中的結果(最大為20.05%)，確定此試驗結果的合理性。

3 結論

本試驗采用四川青見柑橘，通過超聲波輔助酸提取法從橘皮中提取果膠，在單因素試驗和正交試驗優化后得到最佳工藝條件為：pH 1.5，超聲溫度70 ℃，超聲時間40 min，料液比1∶15，此時果膠提取率最大，為22.43%。4個因素的影響順序為：pH>超聲溫度>超聲時間>料液比。該試驗方法條件易控制，成本較低，提取效果好。

通過本試驗研究，為橘皮果膠提取提供了理論依據，同時為綜合利用橘皮副產物在其他領域應用提供了理論參考[13]，如柑橘醋類黃酮化合物生物技術研究[14]、橘皮發酵汁抗氧化性及風味成分研究[15]，為柑橘副產物的多元化、功能化發展提供了技術支撐，增強了柑橘產業的市場競爭力和經濟效益。