響應面法與線性回歸方程在豆腐乳風味物質形成過程分析

陳欣華，朱清坤

(鄭州幼兒師范高等專科學校，鄭州 450099)

豆腐乳品種較多，在發酵生產過程中添加不同的輔助物質，即可形成不同風味特征的豆腐乳，按照豆腐乳顏色劃分，主要分為紅豆腐乳和白豆腐乳。經過多次的改進，豆腐乳的發酵工藝已達到成熟水平，但對于豆腐乳成分及品質進行綜合評價分析的數據較少。豆腐乳品質特性的影響因素較多，主要包括豆腐乳的理化特性和豆腐乳的感官特性。本文采用實驗分析獲取豆腐乳的風味物質成分，并采用響應面與迭代算法結合的方式進行豆腐乳的感官評價。同時對豆腐乳的成分特性進行分析，建立豆腐乳發酵過程中的發酵時間、發酵劑添加量以及發酵溫度對豆腐乳的總糖含量、還原糖含量、總酸含量、pH以及菌落總數的影響關系。

1 實驗方法及目的

在豆腐乳發酵過程中，提取15 mL發酵液置于頂空瓶內，并加入0.4 g氯化鈉，擰緊頂空瓶瓶蓋，放入40 ℃恒溫水浴鍋中進行加熱。將活化萃取插頭插入頂空瓶中，平衡10 min后開始40 min吸附倒計時。萃取吸附完成后，利用氣相色譜與質譜聯用分析的方法進行豆腐乳香氣成分鑒定[1-3]。氣相色譜分析過程中，溫度在40 ℃保持2 min，并以1 ℃/min的升溫速率將溫度均勻升高至100 ℃。再次以4.5 ℃/min的升溫速率將溫度均勻升高至240 ℃，溫度保持4 min，使樣品入口處的溫度為240 ℃，檢測容器內的溫度為250 ℃。

質譜分析條件：采用電子電離源，電子能量要求達到70 eV，離子溫度為230 ℃，同時確保質譜掃描范圍為45～650 m/z[4]。

以豆腐乳中的總糖含量、還原糖含量、總酸含量、pH以及乳酸菌菌落總數為檢測指標，將豆腐乳發酵時間、發酵劑使用量及發酵溫度中某一項作為單一影響因素變量，其余兩項固定，進行豆腐乳發酵過程影響因素實驗[5]。單一因素及其水平見表1。

2 豆腐乳發酵過程單因素實驗

表2 發酵時間對豆腐乳發酵效果影響數據Table 2 The influencing data of fermentation time on the fermentation effect of sufu

由表2可知，隨著發酵時間的增長，豆腐乳中總糖含量和還原糖含量逐漸降低；在發酵初始24 h內，微生物最大程度地利用豆腐乳中的糖來進行生長繁殖，隨著總糖及還原糖含量的降低，乳酸菌的發酵能力降低；微生物生長繁殖過程中，豆腐乳中的總酸含量不斷增加，因此豆腐乳中pH值逐漸減小；發酵初期，由于豆腐乳中含有較多的營養物質，因此菌落生長繁殖快，隨著營養物質的減少，豆腐乳中菌落總數逐漸降低[6-8]。對豆腐乳發酵過程及檢測指標進行綜合分析，最終選取24 h為豆腐乳發酵時間。

表3 發酵劑添加量對豆腐乳發酵效果影響數據

由表3可知，當豆腐乳中發酵劑添加量為0.15 g時，豆腐乳中乳酸菌菌落總數達到最大值，同時總糖含量及還原糖含量逐漸降低。當豆腐乳中發酵劑添加量較少時，菌體的含量少，無法有效地利用豆腐乳的營養物質進行發酵，當菌體含量較多時，豆腐乳的營養成分消耗快，菌體快速進入生長末期[9]。對豆腐乳發酵過程及檢測指標進行綜合分析，最終確定豆腐乳發酵劑添加量為0.15 g。

表4 發酵溫度對豆腐乳發酵效果影響數據Table 4 The influencing data of fermentation temperature on the fermentation effect of sufu

由表4可知，當發酵溫度較低時，豆腐乳中微生物代謝能力較弱，微生物無法大量繁殖，豆腐乳中營養成分無法得到有效發酵。在42 ℃條件下，豆腐乳中的菌落總數達到最大值，總酸含量達到最大值，總糖及還原糖含量最低[10]。由此表明，在42 ℃條件下微生物最大程度地利用豆腐乳中的糖類營養物質進行發酵。

3 豆腐乳發酵過程三因素實驗

利用組合實驗原理，選擇豆腐乳發酵過程中的發酵時間、發酵劑添加量以及發酵溫度為豆腐乳發酵過程自變量，以豆腐乳中的總糖含量R1、還原糖含量R2、總酸含量R3、pH R4以及菌落總數R5為響應值，設計豆腐乳發酵過程中的三因素三水平實驗。豆腐乳發酵過程三因素三水平實驗結果見表5。

表5 豆腐乳發酵過程三因素三水平實驗結果Table 5 The experimental results of three factors and three levels in the fermentation process of sufu

對表5中實驗結果進行二次線性回歸，得到豆腐乳中R1、R2、R3、R4以及R5的回歸方程。

總糖含量R1=5.08+1.54A+0.24B-0.72C-0.35AB+0.27AC+0.68BC-1.42A2-0.96B2-0.027C2；

還原糖含量R2=4.20-0.76A-0.16B+0.12C+0.21AB-0.21AC-0.18BC+0.40A2+0.023B2+0.003C2；

總酸含量R3=0.13-0.0056A+0.0065B+0.01C-0.009AB-0.011AC-0.0000075BC+0.024A2+0.0008B2+0.01C2；

pH R4=0.12+0.00088A-0.0038B+0.0075C+0.0028AB+0.00016AC-0.011BC+0.0018A2+0.009B2+0.006C2；

菌落總數R5=8.53+0.048A+0.3B-0.09C-0.02AB-0.15AC-1.06BC-0.85A2-0.2B2-0.47C2。

利用豆腐乳發酵過程回歸方程確定豆腐乳發酵過程的最佳工藝參數，并對回歸方程數學模型進行分析得出發酵條件因素對發酵工藝的影響顯著性[11]。在豆腐乳發酵過程中，pH因素對發酵工藝的影響最明顯，菌落總數對發酵工藝的影響最不明顯。各影響因素對發酵過程效應分析結果見表6。

表6各影響因素對發酵過程效應分析結果

4 響應面分析

根據發酵過程二次線性回歸方程得出不同因素的響應面分析圖，見圖1～圖5。從響應面分析圖中可以直觀得出不同發酵條件相互作用時豆腐乳發酵參數變化過程。當圖中曲線坡度較大時，說明該發酵條件對豆腐乳的發酵過程影響越顯著；當圖中曲線坡度較平滑時，說明該發酵條件對豆腐乳的發酵過程影響顯小。

圖1 各因素對豆腐乳總糖含量影響的3D響應面Fig.1 Effects of various factors on total sugar content in sufu by 3D response surface diagrams

圖2 各因素對豆腐乳還原糖含量影響的3D響應面Fig.2 Effects of various factors on reducing sugar content in sufu by 3D response surface diagrams

圖4 各因素對豆腐乳pH影響的3D響應面Fig.4 Effects of various factors on pH values sufu by 3D response surface diagrams

5 實驗驗證及成分分析檢測

根據響應面分析結果及實驗模擬分析，確定豆腐乳發酵過程達到最佳工藝條件時，發酵時間為27 h，發酵劑添加量為0.15 g，發酵溫度為40 ℃。經過發酵實驗后，測得豆腐乳中總酸含量為5.5 g/L，pH為4，總糖含量為0.13 g/L，還原糖含量為0.12 g/L，豆腐乳中乳酸菌菌落總數達到8.8 CFU/mL。與二次線性回歸方程模型數據進行對比，二者之間具有較好的擬合度。

發酵完成后，對豆腐乳中的各類成分進行檢測，并與發酵前豆腐乳發酵液中的各類成分進行對比，豆腐乳中各種揮發性風味物質成分數據見表7，數量用有效個數進行表示。

表7 豆腐乳發酵前后風味物質對比數據(有效個數)Table 7 The comparative data (effective number) of flavor compounds before and after fermentation of sufu

由表7可知，發酵前后，豆腐乳中的揮發性風味物質含量發生明顯的變化，在發酵前豆腐乳發酵液中含有較多的烯類物質，醇類物質含量較低。豆腐乳發酵完成后，部分風味物質消失，烯類物質含量明顯降低，同時生成新的揮發性風味物質。

6 結論

豆腐乳的獨特風味是由各種風味物質之間相互作用形成的，并非一種風味物質或一類風味物質單獨形成。在豆腐乳的發酵過程中，在各種發酵條件因素的影響作用下，發生一系列的生化反應，同時豆腐乳中的微生物也不斷地代謝，形成各種不同的風味物質。生化反應和微生物代謝使豆腐乳中的部分物質消失，同時生成其他新的物質，從而形成新的風味物質。