基于細菌多樣性對蔬菜發酵制品分析評價

王倩倩，邱泳明，遲雪梅，賈倩雯，任楠楠，遲乃玉，張慶芳*

(1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622)

草菇(Volvariellavolvacea(Bull.ex Fr.) Sing.)肉質脆嫩，味道鮮美，維生素含量高，并富含多種氨基酸和礦物質元素[1-2]；白菜(Brassicapekinensis(Lour.) Rupr.)又稱“百菜之王”，營養價值高，已發現白菜中含有預防腫瘤的成分[3]。發酵制品是利用益生菌發酵而成的一類特殊食品，以其獨特的風味和多種保健功能而越來越受到消費者歡迎。多種微生物在發酵制品的發酵過程中扮演著重要角色，其能將原料中的蛋白質分解為氨基酸和多肽，將脂肪分解為短鏈的揮發性脂肪酸和酯類物質[4-5]，微生物的代謝產物與原料分解產物共同形成了發酵制品特有的風味和品質特征。臨床研究證實發酵制品中特有的益生菌[6]對胃腸疾病和過敏性疾病有積極的作用；研究顯示益生菌還可用于治療肥胖癥、胰島素抵抗綜合征、Ⅱ型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病。乳酸菌作為發酵制品中最為豐富的菌群[7]，不僅能改善食品的品質和營養，還具有降低膽固醇、防止乳糖不耐受癥、止腹瀉、抗腫瘤、抗變異原、增強免疫力、清除自由基和延緩衰老等重要功能。

本研究采用白菜和草菇為基本原料，添加蜂蜜(或冰糖)及食鹽，進行接種乳酸菌(或添加酸奶，或自然發酵)，見表1。在相同工藝條件下制作發酵制品，根據感官評價和相關的理化指標，從12個發酵制品中，挑選出4種最佳發酵產品，序號為1號(BC4)、2號(BC1)、7號(XG12)、8號(XG10)，進行16S rDNA高通量測序；分析微生物的多樣性及潛在功能，為發酵制品的安全與營養提供了理論依據，用以評價蔬菜發酵制品的品質；同時也為其更進一步作為益生菌飲料[8]的生產和開發等提供了理論指導。

表1 蔬菜發酵制品配方Table 1 The formula of fermented vegetable products

1 材料與方法

1.1 實驗材料

遼寧省海洋微生物工程技術中心培育的新鮮草菇、市售新鮮白菜(大連91-12)、蜂蜜(購于超市)、錦州雙八乳業有限公司生產的新鮮酸奶(含有Lactobacillusbulgaricus和Streptococcusthermophilus，按1∶1的比例)。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵制品的制備

挑選草菇和鮮嫩、無枯葉、無病葉的白菜，用流水清洗，切碎成小塊(1 cm寬)；在90 ℃熱水中燙漂10 min；將處理好的100 g草菇、白菜在火焰旁分別裝入消毒后的廣口瓶中，加入10 g蜂蜜、0.5%的鹽，最后加入300 mL水；設置不同處理(即不添加，添加5%酸奶)；補水至瓶口；蓋上磨口的瓶蓋，用封口膜密封。將其放置在地下室柜中，避光，發酵溫度為17 ℃，發酵周期為30 d。4種發酵制品代號分別為BC1、BC4、XG10、XG12，配方見表2。

表2 草菇和白菜發酵制品配方

1.2.2 亞硝酸鹽殘留量的測定

采用鹽酸萘乙二胺法[9]。

1.2.3 pH值的測定

使用精密pH計直接讀數。

1.2.4 糖度的測定

使用糖度計直接讀數。

1.2.5 發酵制品基因組DNA的提取

發酵制品基因組DNA的提取方法參見文獻[10]，DNA樣品經純化后進行PCR擴增。

1.2.6 發酵制品16S rDNA測序

細菌多樣性研究主要是基于16S rDNA(V3+V4)區。細菌V3+V4擴增采用的引物：338F： 5′-ACTCCTA-CGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3′F，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，對于建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用 Illumina HiSeq 2500進行測序。測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.7 生物信息分析流程

數據預處理：根據PE reads之間的Overlap關系，將HiSeq測序得到的雙端序列數據拼接(Merge)成一條序列Tags，同時對Reads的質量和Merge的效果進行質控過濾[11]。

信息分析內容：使用QIIME(Version 1.8.0)軟件中的Uclust[12]Tags在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU，并基于Silva(細菌)分類學數據庫對OTU進行分類學注釋；使用Mothur(Version v.1.30)軟件[13]對樣品Alpha多樣性指數進行評估；利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學水平下的群落結構圖；使用PICRUSt軟件通過比對16S rDNA測序數據獲得物種組成信息。

2 結果與分析

2.1 樣本測序數據質量評估

通過高通量測序平臺，得到Raw Tags，按測序數據質量[14]要求處理后，對序列進行組裝拼接，得到Clean Tags序列，各樣品測序數據結果見表3。

表3 樣品測序結果統計Table 3 The statistics of sample sequencing results

2.2 基于OTU的Venn圖分析

在97%的相似度水平下，聚類成可操作分類單元(OTU)，通過聚類BC1、BC4、XG10和XG12樣品各得到52，12，16，21個OTU。利用Venn圖[15]可以展示樣品之間共有、特有OTU數目，直觀地表現出樣品間OTU的重合情況。結合OTU所代表的物種，可以找出不同環境中的共有菌群。

圖1 OTU-Venn圖

由圖1可知，OUT數在4個制品之間共有10個，樣品BC1和BC4之間共有12個，樣品BC1和XG10之間共有13個，樣品BC4和XG12之間共有10個，樣品XG10和XG12之間共有14個；樣品BC1特有34個，樣品BC4特有0個，樣品XG10特有2個，樣品XG12特有4個。

2.3 Alpha多樣性分析

為比較樣品間的多樣性指數，分析時將樣品所含序列數進行標準化。在97%相似度水平下，各樣品Alpha多樣性指數值統計見表4。Chao1和Ace值越大，說明樣品的物種豐度越大。Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，說明樣品的物種多樣性越高。

表4 Alpha多樣性指數統計

由表4可知，ACE指數BC1>XG12>BC4>XG10，Chao1指數BC1>XG12>XG10>BC4，因此可知，添加酸奶的白菜發酵制品的物種豐度極顯著大于其他3種發酵制品的物種豐度，在草菇制品中，自然發酵制品的物種豐度大于添加酸奶制品的物種豐度；Shannon指數XG10>XG12>BC1>BC4，Simpson指數XG10

2.4 物種組成與結構分析

將OTU的代表序列與細菌參考數據庫進行比對可得到每個OTU對應的物種分類信息，進而在各水平(門、綱、目、科、屬、種)統計各樣品群落組成。

2.4.1 屬等級分類

表5樣品中主要微生物屬組成

在屬等級上，BC1注釋得到36個屬，BC4注釋得到9個屬，XG10注釋得到12個屬，XG12注釋得到16個屬。由表5可知，4種樣品中優勢菌屬均為Lactobacillus，所占比例分別為88.97%、90.65%、67.63%、69.46%，Leuconostoc在XG10和XG12中比例分別為29.51%和30.10%，兩種菌屬在4種樣品中的累計相對含量分別為90.24%、94.69%、97.15%、99.56%，均高于90%。

2.4.2 種等級分類

在種等級上，BC1注釋得到27個種，BC4注釋得到5個種，XG10注釋得到6個種，XG12注釋得到9個種。

表6 樣品中主要微生物種組成Table 6 The composition of main microbial species in the samples %

由表6可知，4種樣品中優勢菌種均為Lactobacillusplantarum，所占比例分別為88.84%、90.65%、67.63%和69.46%，Leuconostocpseudomesenteroides在4種樣品中所占比例分別為1.27%、4.04%、29.51%和30.10%，unculturedBacteriumgStreptococcus在4種樣品中所占比例分別為1.63%、0%、1.91%和0.02%，其余種比例在BC1、BC4、XG10和XG12中均低于0.50%。

2.5 16S功能基因預測分析

使用PICRUSt比對16S測序數據獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異[16]。

2.5.1 COG功能預測

同等原料的2個發酵制品COG功能預測比較結果見圖2和圖3。

由圖2和圖3可知，影響發酵制品營養的功能代謝途徑有多項顯示，如碳水化合物代謝組、氨基酸代謝組、能量代謝組、輔助因子和維生素代謝組及運輸和分解代謝組等。由圖2可知，BC1與BC4之間，在菌群群落的功能分布及所占豐度上存在顯著性差異和變化，各功能項上BC1顯著性大于BC4的為16項，BC4顯著性大于BC1的為5項；由圖3可知，XG10與XG12之間，在菌群群落的功能分布及所占豐度上也存在差異和變化，各功能項上XG10顯著性大于XG12的為8項，XG12顯著性大于XG10的為2項，說明添加酸奶對發酵制品的COG功能影響較大。

圖2 樣品BC1、BC4的COG功能分類統計圖Fig.2 COG function classification statistics of BC1 and BC4 samples

圖3 樣品XG10、XG12的COG功能分類統計圖Fig.3 COG function classification statistics of XG10 and XG12 samples

2.5.2 KEGG功能預測

同等原料的2個發酵制品KEGG功能預測比較結果見圖4和圖5。

圖4 樣品BC1、BC4間KEGG代謝途徑的差異分析圖Fig.4 Differential analysis of KEGG metabolic pathway between BC1 and BC4 samples

圖5 樣品XG10、XG12間KEGG代謝途徑的差異分析圖Fig.5 Differential analysis of KEGG metabolic pathways between XG10 and XG12 samples

由圖4和圖5可知，除了碳水化合物的運輸與代謝與氨基酸代謝等在樣品中的表達較強之外，傳染病、癌癥等影響樣品安全的功能代謝途徑非常少而且表達水平低。由圖4可知，BC1與BC4之間，在菌群群落的功能分布及所占豐度上存在顯著性差異和變化，各功能項上BC1顯著性大于BC4的為21項，BC4顯著性大于BC1的為7項；由圖5可知，XG10與XG12之間，在菌群群落的功能分布及所占豐度上也存在差異和變化，各功能項上XG10顯著性大于XG12的為8項，XG12顯著性大于XG10的為3項，說明添加酸奶對發酵制品的KEGG功能影響較大。

3 討論

本研究發現草菇和白菜發酵制品中主要菌群都為益生菌中的乳酸菌。草菇發酵制品中，無論是添加酸奶還是自然發酵，其優勢菌都是Lactobacillusplantarum(添加酸奶發酵：67.63%、自然發酵：69.46%)和Leuconostocpseudomesenteroides(添加酸奶發酵：29.51%、自然發酵：30.10%)。白菜發酵制品中，無論是添加酸奶還是自然發酵，其優勢菌都是Lactobacillusplantarum(添加酸奶發酵：88.97%、自然發酵：90.65%)，也有Leuconostocpseudomesenteroides，但比例較少(添加酸奶發酵：1.27%、自然發酵：4.04%)。因此發現白菜發酵制品中Lactobacillusplantarum所占比例遠高于草菇發酵制品，草菇發酵制品中Leuconostocpseudomesenteroides所占比例遠高于白菜發酵制品。近年來研究發現，Lactobacillusplantarum具有降解亞硝酸鹽功能，能夠降低亞硝胺的致癌性；臨床實驗證實Lactobacillusplantarum對Ⅱ型糖尿病治療起輔助作用，可以使葡萄糖和同型半胱氨酸水平顯著降低；可以降低人體身體質量指數(BMI)和動脈血壓值；可以改善乳糖消化和耐受性，對腹瀉和胃腸脹氣有明顯的改善作用，還可以改善腸黏膜屏障的完整性并減少感染并發癥等[17]；在蔬菜發酵制品中Lactobacillusplantarum可以從蔬菜的膳食纖維中制造短鏈脂肪酸，可以誘導結腸癌細胞的凋亡，可能有助于預防結腸癌[18]。Leuconostocpseudomesenteroides是得到美國FDA認可的GRAS菌[19]，又稱風味菌、香氣菌和產香菌，具有改善人體腸道環境，抑制某些病原菌等功能[20]。因此，本實驗研究的草菇和白菜發酵制品都適合作為益生菌飲料產品。

本研究發酵制品基于高通量測序得到注釋的細菌屬、種主要為益生菌中的乳酸菌，占比達90%。除此以外，有可能影響產品安全的細菌占比極低或不能培養(見表5和表6)，對產品不構成影響。因此，從主要微生物屬、種組成方面也說明了本研究的發酵制品具有安全性，再者本研究發酵制品的KEGG功能預測得到的結果(見圖4和圖5)也顯示，影響發酵制品安全的功能代謝途徑顯示的非常少而且水平低。

白菜是屬于含有大量硝酸鹽的蔬菜[21]。在白菜發酵過程中，因發酵初期會有產硝酸鹽還原酶的菌存在，從而將硝酸鹽大量地還原成亞硝酸鹽，NO2-能與蛋白質代謝物反應生成強致癌物亞硝胺。本實驗室及其他學者[22]研究發現Lactobacillusplantarum具有亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，NiR)基因，能在NO2-的誘導下產生NiR；Lactobacillusplantarum降解NO2-的途徑為產NH3途徑，最終產物為NH3。環境pH值>4.5時，主要是在NiR作用下分解亞硝酸鹽。Lactobacillusplantarum屬于同型乳酸發酵，產酸能力較強，能快速使環境pH值<4.0，從而迅速進入NO2-被H+降解階段[23]。草菇是屬于含極少量硝酸鹽的蕈菌[24]，其發酵制品中亞硝酸鹽含量也少。可能也是本研究的發酵制品中亞硝酸鹽含量都低的原因(國家限量標準<20 mg/kg)，見表7。

表7 草菇和白菜發酵制品中NO2-殘留量Table 7 NO2- residues in fermented products of Volvariella volvacea and cabbage mg/kg

通過分析OTU聚類數、豐度指數、物種注釋數，其中BC1數值均高于其他樣品，但發酵制品中優勢菌群仍主要為乳酸菌。分析原因：白菜中含有大量的硝酸鹽作為氮源，添加蜂蜜提高了碳源的量，致使發酵環境中存在大量的氮源和碳源及合適的碳氮比，添加的酸奶中富含半乳糖和乳酸、小的肽鏈和氨基酸、脂肪酸等大量營養因子和乳酸菌等；富集的營養條件使發酵前期各種細菌生長旺盛；導致白菜發酵前期大量硝酸鹽降解產生亞硝酸鹽。亞硝酸鹽可作為防腐劑[25]，又抑制了大量其他菌的生長；乳酸菌本身產生的酸及乳酸菌素又能抑制發酵中的雜菌[26]；研究還認為Lactobacillusplantarum耐受亞硝酸鹽的能力較強，耐酸能力較強[27]。因此，在發酵制品中檢測到優勢乳酸菌為Lactobacillusplantarum。在BC1中檢測到亞硝化菌，亞硝化菌能使NH3生成NO2-，在H+的作用下NO2-生成NO和NO3-[28]；研究[29]中常見蔬菜發酵后期，汁液中NO3-和NO2-含量出現低頻率的反復波動現象，推測可能與存在氮代謝有關的菌相關。在添加酸奶的發酵制品中還檢測到了Streptococcus(白菜：1.63%、草菇：1.91%)，可能與添加的新鮮酸奶中含有Streptococcusthermophilus有關。

在COG功能預測中，BC1和BC4比較顯著性差異為21項，XG10和XG12比較顯著性差異為10項。在KEGG功能預測中，BC1和BC4比較顯著性差異為28項，XG10和XG12比較顯著性差異為11項。因此，以草菇為原料的2個制品有顯著性差異的功能項數量遠遠少于以白菜為原料的2個制品有顯著性差異的功能項數量。就功能預測指標分析及工藝成本考慮，以白菜為原料的制品，可首選BC1(添加酸奶)；以草菇為原料的制品，可首選XG12(自然發酵)。

對本研究中的草菇和白菜發酵制品，測定pH、糖度和總酸等理化指標(pH在3.1～3.4之間，糖度在8%～10%之間，總酸在0.29%～0.35%之間)，顯示符合人們正常口感需要[30]，見表8。

表8 樣品主要理化組成Table 8 The main physical and chemical components of samples

4 展望

本研究采用高通量測序技術對制備的草菇和白菜發酵制品進行細菌多樣性分析及功能預測，在4個發酵制品中檢測到的優勢菌主要是對人體有臨床療效的Lactobacillusplantarum，功能預測分析發酵制品都具有安全性和營養性，發酵制品中亞硝酸鹽殘留量低于安全標準，糖酸比符合大眾口味。綜上，可以認為這4個發酵制品適合作為益生菌飲料進行產品化。