外膜蛋白ompC過表達提高大腸桿菌對慶大霉素敏感性研究

馬月龍，賴澤迎，馮荊城，林少青，陳雅娟

(細胞逆境響應與代謝調控福建省高校重點實驗室/福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350108)

慶大霉素1966年在我國被王岳教授首次分離，并實現工業生產，它是畜牧養殖業重要的氨基糖苷類抗生素之一，伴隨著其長期大量的使用，耐藥性問題日益突出造成慶大霉素的有效利用率顯著降低[1-2]，從細胞水平尋找耐藥菌對抗生素的敏感位點使其重新發揮作用迫在眉睫。本研究發現外膜蛋白ompC過表達能夠極顯著提高慶大霉素對大腸桿菌的殺傷效果，這可以有效阻止抗生素耐藥性在農業養殖業中的蔓延，具有二次利用現有慶大霉素快速將致病菌進行殺滅的重大價值。目前關于大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥性機制的認識主要包括三個方面：一是大腸桿菌對氨基糖苷類藥物細胞內積累量的降低[3]；二是氨基糖苷類抗生素鈍化酶對氨基糖苷類抗生素產生了修飾行為[4-5]；三是突變或甲基化修飾改變了氨基糖苷類抗生素在細菌核糖體30S亞基中16S rRNA上的結合作用位點。其中后兩種機制可造成更高水平的耐藥性[6-7]， 針對大腸桿菌對慶大霉素耐藥性問題，在體外水平上，目前主要采用聯合防治策略，通過慶大霉素與其他抗菌藥物的聯合使用，特別是與β-內酰胺類抗生素協同使用使其成為在養殖業抗擊病原菌嚴重感染中的利器[8]。在體內水平上，趙艷娜等[9]創新性提出，可通過快速冷凍提高藥物在菌體胞內的積累達到清除致病菌的目的。另有呂波燕等[10]研究表明低離子休克能夠增強耐藥菌對慶大霉素的攝取，從而造成對病原菌的殺滅。多項研究有力表明離子通道蛋白可作為有力的潛在藥敏靶點[11-12]。同時，醇類、吲哚及抗菌肽等代謝物被報道能輔助慶大霉素殺滅致病性大腸桿菌[13-14]，然而目前尚未有研究表明外膜蛋白在慶大霉素對致病性大腸桿菌的殺菌效果上具有潛在的作用。

本研究借鑒前人經驗聚焦于大腸桿菌外膜蛋白家族，以期在眾多外膜蛋白中發現新的有助于菌體攝取慶大霉素的敏感結合位點，發掘外膜孔蛋白上在應對慶大霉素耐藥性的潛在價值。大腸桿菌膜上主要的孔蛋白ompC非常豐富，并且都具有陽離子選擇性[15]，有極大的可能性利于菌體對抗生素的額外攝取。故本試驗提出假設，過表達孔蛋白ompC是否有助于抗生素通過細菌膜進入胞內起到殺菌的目的。本研究通過使用pCA24N表達載體構建大腸桿菌外膜蛋白過表株W3110-p4A24N(ompC)，并與野生型進行慶大霉素殺傷效果比較，測試大腸桿菌ompC過表達對慶大霉素殺菌效果的影響。利用免疫印跡法探究ompC蛋白表達量與慶大霉素殺菌效果的關系，并進一步測定過表達菌株的MIC，以評估大腸桿菌膜孔隙蛋白在抗生素體內的殺傷作用，以期望發現新的藥敏靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗采用的菌株見表1。

表1 菌株的名稱及其來源

1.2 抗生素類型

所用抗生素和使用濃度見表2。

表2 抗生素名稱和使用濃度

1.3 主要儀器

超低溫冰箱(-80℃)、潔凈工作臺、恒溫震蕩培養箱(37℃)、紫外可見分光光度計、掃描儀、蛋白質電泳系統、電泳儀、制冰機、加熱制冷型金屬浴連接儀、蛋白質凝膠轉印系統、水平搖床、垂直脫色搖床等。

1.4 試驗方法

1.4.1過表達載體W3110-pCA24N(ompC)測序驗證 從-80℃超低溫冰箱的ASKA文庫中選取W3110-pCA24N(ompC),劃在氯霉素抗性固體LB固體培養基平板上，挑取單克隆，再用新鮮氯霉素抗性液體LB培養基恒溫培養箱培養12～16 h,用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取質粒(依照產品說明書操作)，取0.2 mL到EP管中，用已合成的上下游引物p-sfiⅠ和p-NotI送去公司對提取的質粒進行基因序列的驗證，引物序列見表3。

表3 引物序列

1.4.2免疫印跡法檢測ompC過表達情況 將W3110-pCA24N、W3110-pCA24N(ompC)按1∶100的接菌比例轉接至含氯霉素抗性的液體LB中，在搖床中培養至OD600≈0.5～0.6時加不同濃度的IPTG(一種誘導蛋白表達的試劑，全名為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(0.1、0.5、1 mmol·L-1)，繼續放置在搖床中誘導至OD600≈0.8,之后取菌液1 mL，12 000 r·min-1轉速離心機離心2 min，棄上清加入30 μL的10% SDS溶液和30 μL的6× loading buffer，混合均勻，置于100℃的金屬浴上煮沸15 min。用10%的SDS-PAGE凝膠電泳將樣品進行分離，電泳液為1×SDS電泳緩沖液。凝膠電泳結束后，使用PVDF膜進行轉膜。轉膜結束后封閉液封閉1 h。封閉結束后，加入一抗，置于水平搖床上反應30 min后，置于4℃冰箱過夜靜置12 h。過夜后的膜置于垂直脫色搖床上，用1× TBST緩沖液洗滌3次，每次間隔8～10 min。洗滌后置于水平搖床上，加入二抗反應1.5 h，再換置于搖床上，用1×TBST緩沖液洗滌3次，每次間隔8～10 min。最后進行BCIP/NBT試劑顯色。

1.4.3ompC過表達菌株抗生素敏感性檢測 將菌株W3110-pCA24N、W3110-pCA24N(ompC)預先活化。將活化好的菌液1∶100轉接至含氯霉素液體LB中，置于搖床中培養至OD600≈0.5～0.6時加入終濃度分別為0.1、0.5、1 mmol·L-1的IPTG，繼續放置于搖床中誘導至OD600≈0.8。取菌液100 μL于EP管中，12 000 r·min-1離心2 min，去上清，用等體積的0.01 mol·L-1PBS緩沖液重懸作為對照樣品備用。取1 mL誘導至OD600≈0.8的菌液于玻璃搖菌管中，離心去上清，加入10% SDS溶解液和6×loadiong buffer緩沖液進行制樣后進行免疫印跡檢測蛋白表達情況，同時取1 mL離心去上清，采用慶大霉素對過表達誘導程度不同的大腸桿菌進行處理，置于搖床中培養，45 min后取100 μL于EP管中，離心后去上清，用等體積的0.01 mol·L-1PBS緩沖液重懸作為試驗樣品，將以上樣品用緩沖液梯度稀釋后點板，平板在37℃過夜培養12 h，觀察細菌存活情況，根據菌落計數，計算存活率。取3次平行試驗的結果進行顯著性分析。

1.4.4ompC過表達菌株最小抑菌濃度(MIC)測試 最小抑菌濃度MIC是抑制細菌生長所加的最小的藥物濃度，同時這也是判斷藥物是否有效的標準。國際抗菌素協會規定用二倍稀釋法來確定MIC[16]。

將活化好的W3110-pCA24N、W3110-pCA24N(ompC)按1∶100轉接至含氯霉素液體LB中，置于搖床中培養至OD600≈0.5～0.6時加入濃度為1 mmol·L-1的IPTG，繼續放置于搖床中誘導至OD600≈0.8。2倍稀釋法將抗生素稀釋成相應濃度(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg·mL-1)，在無菌96孔板上按照濃度梯度順序每孔加入200 μL抗生素稀釋液，將誘導后的菌液稀釋5倍后，每個孔中加入2 μL稀釋后的菌液即每孔菌量約為105～106CFU·mL-1，全部上樣完成后，37℃靜置培養24 h。取出96孔板，用槍頭輕輕吹打混勻菌液，在肉眼條件下對光觀察，清澄透光的孔對應的最低抗生素濃度為該菌體外培養最低抑菌濃度(MIC)。

圖1 W3110-pCA24N(ompC)測序結果Fig.1 Sequencing results of W3110-pCA24N (ompC)

2 結果與分析

2.1 過表達載體W3110-pCA24N(ompC)測序驗證

將測序結果在NCBI中進行Blast序列比對，由圖1可知，測序結果與該基因原始序列一致且相似度將近100%。

2.2 免疫印跡法檢測結果分析

由圖2可知，0.1、0.5和1 mmol·L-1IPTG誘導的3個W3110-pCA24N(ompC)分別用A、B、C表示，均成功跑出條帶，提示W3110-pCA24N(ompC)過表達誘導成功(ompC蛋白大小約38 kDa)，并且該蛋白的表達量隨著IPTG濃度的升高而升高。

圖2 不同誘導濃度下W3110-pCA24N(ompC)免疫印跡檢測結果Fig.2 Immunoblotting detecting results of W3110-pCA24N(ompC) at different induced concentrations

2.3 ompC過表達提高大腸桿菌對慶大霉素的敏感性

由圖3可知，經過比對分析，慶大霉素對W3110-pCA24N(ompC)組的殺菌效果明顯強于W3110-pCA24N組，表明過表達ompC能顯著增強大腸桿菌對慶大霉素的敏感性；W3110-pCA24N(ompC)經不同濃度IPTG誘導后大腸桿菌對慶大霉素的敏感性隨著IPTG濃度的升高而增強。

2.4 測定過表達菌株最小抑菌濃度

由圖4可知，過表達ompC后的菌株 W3110-pCA24N(ompC)的最小抑菌濃度8 ug·mL-1明顯低于W3110-pCA24N(野生型)的16 ug·mL-1，表明外膜蛋白ompC的過表達增強了大腸桿菌對慶大霉素的敏感性。

圖3 不同濃度誘導野生型和W3110-pCA24N(ompC)過表達株對慶大霉素的敏感性Fig.3 Sensitivity of the wild-type strain and the over-expressing strain of W3110-pCA24N (ompC) to gentamicin induced by different concentrations

圖4 W3110-pCA24N和W3110-pCA24N(ompC)過表達株最小抑菌濃度測定結果Fig.4 Determined results of the minimum inhibitory concentration of W3110-pCA24N and the over-expressing strain of W3110-pCA24N (ompC)

3 結論與討論

抗生素在防治人和動物疾病、促進畜牧養殖業持續健康發展中起著舉足輕重的作用，但隨著其在農業生產和臨床治療中的廣泛使用甚至濫用，細菌耐藥性問題日益突出。促使抗菌藥物對耐藥菌重新發揮殺菌作用，提高現存抗生素的有效利用率是阻止細菌耐藥現象蔓延的關鍵一步。因此在分子水平上尋找新的藥物敏感位點是必要的。細菌與外界環境的交流主要通過外膜蛋白來進行，同時這也是抗菌藥物進入細菌當中發揮作用的重要通道。如果外膜蛋白的表達量下降，抗菌藥物就無法進入細胞內，宏觀上表現出細菌對該抗菌藥物的耐受性增強[17]。近年來，研究大腸桿菌耐藥機制的方向主要是改變外膜通透性、形成相應水解酶、泵系統外排、改變作用靶位、減小外膜滲透壓以及形成生物被膜等多種方面[18]，已有相關研究表明大腸桿菌可以通過被改變外膜通透性、調節控制外膜蛋白的結構來影響其敏感性[19-20]。

大腸桿菌的外膜蛋白ompC作為其中數量較多的外膜蛋白之一，本研究發現ompC過表達后能夠極其顯著降低大腸桿菌對慶大霉素的存活率，進一步研究發現，與對照相比，最小抑菌濃度(MIC)明顯降低，因此認為外膜蛋白ompC過表達顯著提高了大腸桿菌對慶大霉素敏感性，慶大霉素更多地被攝入大腸桿菌胞內，這使得大腸桿菌對慶大霉素的耐藥性降低，增強了慶大霉素的殺菌效果。這一發現對于治療致病性菌造成的持續性感染疾病有著重要的實踐及理論意義，且該敏感位點是否適用于對其他致病菌的殺滅是值得更深一步探究的地方。