紫紅曲霉固態發酵芝麻粕產蛋白肽的工藝優化

余錦欣，吳學成，白 雪，蔣詠梅，章文賢

(1.福建師范大學生命科學學院， 福建 福州 350007；2.福建飛紅酒業有限公司， 福建 三明 366105)

蛋白肽通常是指蛋白質經蛋白酶水解釋放出來的小分子量肽[1-2]，除了易被機體消化吸收外，還具有降血壓、抗菌、抗氧化、免疫活性調節等多種生物活性[3]，在營養保健品、功能性產品等領域有良好的發展前景。其制備方法主要有酸堿水解法、酶解法和微生物發酵法3種[4]。酸堿水解法氨基酸破壞嚴重，酶解法工藝復雜，比較而言，微生物發酵法生產的蛋白肽分子量更小、活性更高，成本也相對低廉。

芝麻粕是芝麻榨油后主要的農副產物，含有大量的優質蛋白(38%～50%)[5]，是蛋白肽的良好來源。研究者利用米曲霉[6]、枯草芽孢桿菌[7]等菌種發酵芝麻粕生產蛋白肽，袁艷超等[8]將植物乳桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種菌混合發酵芝麻粕，有效地提高了發酵液中的肽含量。目前微生物發酵法產芝麻粕蛋白肽多通過液體發酵方式，固態發酵的相關研究較少，尚未發現利用紫紅曲霉固態發酵芝麻粕產蛋白肽的相關報道。

本研究利用紫紅曲霉固態發酵芝麻粕產蛋白肽，加入糖類碳源物質彌補培養基碳源的不足，以肽得率為指標，通過單因素試驗和正交試驗對固態發酵工藝條件進行優化，為實現芝麻粕蛋白資源的高值化利用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.2主要儀器 SHP-150生化培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，恒溫振蕩器(上海一恒科學儀器有限公司)，UV-1100紫外分光光度計(上海美普達儀器有限公司)，TG16-WSD臺式高速離心機(湖南湘儀儀器有限公司)。

1.1.3主要材料和試劑 芝麻粕，市售；結晶牛血清蛋白，購于阿拉丁試劑有限公司；三氯乙酸、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、碘化鉀，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 培養基

1.2.1斜面培養基 PDA固體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，七水硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3 g，維生素B10.05 g，去離子水1 L，121℃滅菌20 min。

1.2.2種子培養基 葡萄糖35 g，蛋白胨5 g，酵母精粉2.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.1 g，維生素B10.05 g，去離子水1 L，121℃滅菌20 min。

1.2.3固態培養基 使用高速粉碎機將芝麻粕磨成粉末后過20目篩。在250 mL錐形瓶中裝入芝麻粕粉末10 g，含水量為60%。后續根據需要稱量一定質量比的糖類，充分溶解于去離子水中，倒入芝麻粕固態培養基中混合均勻，封口膜包扎，于121℃高壓滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1固態發酵方法 接種環挑取菌絲孢子在PDA斜面培養基上劃線，30℃培養7 d待菌絲長滿斜面。取10 mL無菌水加入斜面，刮取孢子制成孢子懸液，轉移至種子培養基(40 mL)，恒溫振蕩(30℃、120 r·min-1)培養2 d，倒入裝有玻璃珠的無菌錐形瓶振蕩打碎制得種子液。吸取2 mL種子液，均勻接種至已滅菌的芝麻粕固態發酵培養基中，31℃恒溫培養6 d。

1.3.2單因素試驗 以未加入碳源、未接種的芝麻粕培養基為初始培養基條件，以發酵時間6 d、含水量60%、溫度31℃為初始發酵條件，所有試驗均設置3次平行。(1)紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響。將未接種與接種的芝麻粕培養基置于同等條件下恒溫培養，以未接種的芝麻粕培養基為空白對照組，以肽得率為指標，考察紫紅曲霉固態發酵芝麻粕產蛋白肽的能力。(2)碳源類型對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響。以接種未添加碳源的芝麻粕培養基為對照組，分別添加質量比為10%的糖類碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖)，考察不同碳源類型對肽得率的影響。(3)碳源比例對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響。確定最優碳源類型后，分別向芝麻粕固態培養基質中加入不同比例(5%、10%、15%、20%、25%)葡萄糖，考察不同碳源比例對肽得率的影響。(4)發酵時間對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響。確定最優碳源比例后，考察發酵時間(0、2、4、6、8 d)對肽得率的影響。(5)含水量對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響。確定發酵時間后，在添加碳源的芝麻粕培養基中分別以一定比例(30%、40%、50%、60%、70%)加入去離子水，考察含水量對肽得率的影響。(6)溫度對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響。在確定最優含水量后，考察溫度(25℃、28℃、31℃、34℃、37℃)對肽得率的影響。

1.3.3正交試驗 在單因素試驗的基礎上，通過SPSS軟件設計三因素三水平的正交試驗，研究發酵時間、含水量、溫度對肽得率的影響，得出最優組合，進行驗證，確定最優發酵工藝條件。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.4蛋白肽的測定 固態發酵物于50℃烘48 h，磨成細粉，過60目篩。按照料液比1∶10加入發酵物粉末和蒸餾水，于160 r·min-1中振蕩2 h，充分溶解其中的蛋白肽。之后于10 000 r·min-1離心15 min，收集上清液并定容。上清液用0.22 μm濾膜過濾除去菌體碎片和不溶性雜質，備用。

總之，當代計算機科學和形式化數學的發展開創了經典計算主義的時代，計算認知的思想日益深入人心，它順應了當代科學研究活動，特別是計算機科學、信息科學、人工智能以及應用互聯網技術的發展，它是新技術革命背景下誕生的新的哲學思維，無論是從理論的角度，還是從實際應用的角度，都具有重要的意義和價值。但是，在認知、計算等問題上始終存在著激烈的爭議，也暴露了經典計算認知觀念的局限，對那些爭論問題的否定回答，將經典計算主義推向了風口浪尖，經典計算主義陷入了危機之中。

肽得率的測定：參考Ma等[9]的方法稍做調整，采用雙縮脲試劑和比色法測定發酵物上清液中蛋白肽濃度，計算肽得率。取1 mL濾液，加入等體積10%的三氯乙酸(TCA)溶液，靜置30 min后，于8 000 r·min-1離心15 min以去除大分子量蛋白和酸不溶性物質。再取1 mL上清液，加入4 mL雙縮脲試劑進行反應，靜置30 min，測定OD540，根據蛋白標準曲線計算溶液中肽濃度，換算得到發酵物中的蛋白肽總質量。肽得率為發酵物中蛋白肽總質量與培養基的質量比。

雙縮脲試劑的配制：1.5 g硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中，攪拌加入300 mL的10%NaOH溶液，用蒸餾水定容至1 000 mL。

蛋白標準曲線的測定：參考何勇錦等[10]用結晶牛血清蛋白(BSA)配制標準蛋白溶液，用雙縮脲試劑和比色法測定OD540，以BSA溶液濃度(x)為自變量，以吸光度(y)為因變量，得到標準曲線方程為：y=0.046x+0.0027。

2 結果與分析

2.1 紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響

由圖1可知，紫紅曲霉發酵物中肽得率為7.34%，與未接種芝麻粕對照組相比，提高了69%，說明紫紅曲霉具有豐富的蛋白酶體系，能夠將胞外芝麻粕培養基中的蛋白水解為小分子量的肽，可適用于固態發酵芝麻粕生產蛋白肽。

2.2 碳源類型對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響

由圖2可知，在沒有添加碳源的條件下，肽得率偏低，發酵物中的蛋白肽較少。這可能是因為脫脂芝麻粕中蛋白質含量很高，氮源豐富，但其中含碳物質的量不足[5]，影響紫紅曲霉的生長，導致肽得率不高。分別添加10%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖后，肽得率均有提高，說明加入碳源均有利于芝麻蛋白肽的合成。各碳源對肽得率的促進作用依次為葡萄糖>果糖>淀粉>蔗糖>乳糖，其中葡萄糖對肽得率的影響最大，達到12.70%，與未添加碳源的芝麻粕發酵物相比提高了73%，這可能是因為在發酵初期，葡萄糖作為結構最簡單的物質，可直接進入糖酵解途徑，利于菌體的吸收利用。

圖1 紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響Fig.1 Effect on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

圖2 不同碳源類型對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.3 葡萄糖添加量對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響

由圖3可知，當培養基葡萄糖添加量為10%時，肽得率最高，可達12.93%；低于或高于10%添加量，肽得率都有所降低。這可能是因為低濃度糖類容易被紫紅曲霉吸收，從而促進菌體生長，分泌更多的蛋白酶將基質中的蛋白水解成肽；當糖類濃度過高時，基質黏度增大溶氧不足，影響菌絲在培養基質內部的擴散，從而影響最終的肽得率。

圖3 不同葡萄糖添加量對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響Fig.3 Effect of different glucose addition on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.4 發酵時間對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響

由圖4可知，隨著發酵天數的增加，肽得率持續升高，直到第6 d達到峰值12.96%，然后趨于平緩，第8 d肽得率稍有降低，說明發酵前中期可能是酶促反應最快速的時期，發酵物中蛋白肽不斷生成和積累，而由于氮源逐漸被消耗，在發酵后期這些蛋白肽可能會進入代謝循環，導致肽得率降低。因此，選擇發酵時間6 d進行后續試驗。

圖4 發酵時間對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.5 含水量對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響

由圖5可知，當培養基含水量為50%時，肽得率最高可達14.49%。當含水量較低時，肽得率偏低，原因可能是菌絲生長和酶解反應均需要水分，而低含水量不利于菌絲生長和代謝；高含水量使得培養基過于濕潤，影響基質間透氣，不利于菌絲在基質內部擴散，導致部分基質未能被充分利用，從而影響蛋白肽的生成。因此，選擇50%含水量進行后續試驗。

圖5 含水量對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響Fig.5 Effect of water content on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.6 溫度對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響

由圖6可知，在溫度為25℃時，肽得率最低；在溫度為31℃時，肽得率最高可達14.52%。這可能是因為較低的溫度不利于酶解反應的進行，從而影響蛋白肽的生成；而在一定范圍內較高的溫度對基質中蛋白的酶解反應有促進作用，此時酶系活躍[11]，各種成分代謝旺盛。因此，選擇31℃為進行后續試驗。

圖6 溫度對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響Fig.6 Effect of temperature on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.7 正交試驗結果

由表2可知，以肽得率為考察指標，從發酵時間(A)、含水量(B)、溫度(C)3個因素中確定最佳發酵工藝條件。極差分析可知，3個因素對肽得率的影響強度順序依次為B(含水量)>A(培養時間)>C(溫度)。優化后的最佳組合方案為A2B2C2，即發酵時間6 d、含水量50%，溫度31℃。以正交試驗結果所得到的最佳發酵工藝條件進行驗證試驗，最終測定肽得率為14.95%，高于正交試驗表格中的結果，可確定該組合是最佳試驗方案。

表2 正交試驗結果分析

3 討論與結論

本研究以芝麻粕為發酵原料，采用紫紅曲霉固態發酵芝麻粕產蛋白肽。采用單因素試驗分別考察了碳源種類、碳源比例、發酵時間、含水量、溫度對紫紅曲霉發酵芝麻粕產蛋白肽得率的影響，通過正交試驗確定最優發酵工藝條件。結果表明，碳源的加入能促進芝麻粕蛋白水解，其中葡萄糖的效果最為明顯，葡萄糖添加量為10%時，肽得率最高達到12.93%，說明葡萄糖是最容易被菌絲吸收利用的營養碳源。在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗確定發酵時間6 d、含水量50%、溫度31℃是最優發酵工藝條件，經驗證后肽得率最高可達14.95%，是未接種芝麻粕基質的2.44倍，該結果高于米曲霉液體發酵芝麻粕產蛋白肽得率[5]，說明采用紫紅曲霉固態發酵芝麻粕產蛋白肽的方法可行，可以為芝麻粕蛋白的高值化利用提供數據參考。