不同碳氮源配比對脫氮生絲微菌FJNU-R8生長和PQQ合成的影響

丁靈濤，劉東方，黃建忠

(福建師范大學生命科學學院/工業(yè)微生物發(fā)酵技術國家地方聯合工程研究中心， 福建 福州 350108)

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)是繼煙酰胺和核黃素之后發(fā)現的第3種輔酶[1-2]，可以在氧化還原反應中參與電子傳遞[3]，具有特殊的生物活性和生理功能。研究發(fā)現，PQQ催化氧化還原反應能力極強[4]，可以清除自由基[5-7]，修復氧化損傷的神經細胞[8]，刺激神經因子增長[9]，促進線粒體合成[10]，提高生物體生長和代謝水平[11]。匡煒等[12]學者研究發(fā)現利用PQQ對水稻種子進行浸種處理后直播，并在始穗期葉面噴灑PQQ，可顯著提高結實率；李震等[13]研究發(fā)現灌根和施用一定量的PQQ，可以顯著改良土壤理化性質；焦子偉等[14]通過試驗證明PQQ處理可以促進玉米生長。因此，PQQ在醫(yī)療、農業(yè)和化妝品等領域有極為廣泛的應用前景。

目前，合成PQQ的方法主要有化學合成[15]和生物合成[16]兩種方法。其中，化學合成法存在工藝路線復雜、生產效率較低、副產物較多、下游純化成本較高等問題。微生物發(fā)酵法生產PQQ則有成本低、反應條件溫和、發(fā)酵過程添加物簡單、易于分離純化等諸多優(yōu)勢，成為工業(yè)化生產的優(yōu)選策略。研究表明，用于合成PQQ的菌株多為革蘭氏陰性菌[17-19]，尤其以甲基營養(yǎng)菌的合成能力最強，雖然現階段有關PQQ合成的代謝途徑已基本闡明[20]，但通過代謝工程手段改造原始菌株依然存在不小的困難。因此，目前提高PQQ產量的方法以篩選高產菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化為主，比如柯崇榕[21]通過高濃度甲醇誘變選育出了1株PQQ高產菌株；張靜等[22]以HyphomicrobiumdenitrificansCGMCC 1.12893為出發(fā)菌，通過ARTP誘變篩選到1株PQQ高產突變菌株，進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后將產量提高了3.4倍。

然而，這些高產突變菌株實際發(fā)酵周期很長，勢必影響實際工業(yè)化生產總量，究其原因無非是菌株延滯期和對數生長期時間較長、PQQ生產啟動緩慢等主要因素。本研究以脫氮生絲微菌 FJNU-R8(HyphomicrobiumdenitrificansFJNU-R8)為出發(fā)菌株，仔細探究了不同的碳氮源對菌株生長和PQQ合成的影響，同時分析了菌株生長和PQQ合成的相互聯系，以期為實際發(fā)酵策略調整提供理論上的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1菌株 本試驗所選用的菌株為脫氮生絲微菌FJNU-R8，由本課題組從污水中篩選并誘變選育后獲得，保藏于工業(yè)微生物教育部研究中心。

1.1.2培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：4 g·L-1(NH4)2SO4、3 g·L-1KH2PO4、3 g·L-1Na2HPO4、1.6 g·L-1MgSO4·7H2O、25 mg·L-1CaCl2、5 mg·L-1ZnSO4、0.5 mg·L-1FeSO4、5.0 g·L-1CH3OH、0.4 mL·L-1微量元素和1 mL·L-1維生素；發(fā)酵培養(yǎng)基：2 g·L-1(NH4)2SO4、3 g·L-1KH2PO4、3 g·L-1Na2HPO4、1.6 g·L-1MgSO4·7H2O、25 mg·L-1CaCl2、5 mg·L-1ZnSO4、0.5 mg·L-1FeSO4、20.0 g·L-1CH3OH、0.4 mL·L-1微量元素和1 mL·L-1維生素；微量元素：15 mg·L-1NaCl、5 mg·L-1CuSO4·5H2O、5 mg·L-1MnSO4·4H2O、0.3 mg·L-1KI、0.1 g·L-1COCl2·6H2O、3 g·L-1H3BO3；維生素配方：2 g·L-1核黃素、4 g·L-1鹽酸吡哆素、4 mg·L-1鹽酸硫胺素、2 g·L-1葉酸、400 mg·L-1煙酸、20 mg·L-1對氨基苯甲酸、40 mg·L-1泛酸鈣、2 mg·L-1生物素、20 mg·L-1肌醇。所用化學試劑均為分析純。

1.1.3儀器與設備 雙層恒溫搖床ZWB-3212B購自上海智城分析儀器制造有限公司；高效液相色譜儀e2695購自沃特世科技(上海)有限公司；紫外可見分光光度計UV-1800購自日本島津公司；貝克曼J-26冷凍離心機購自美國貝克曼有限公司；科瑞峰超純水系統SP-D1-20L購自四川德立世科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1搖瓶培養(yǎng)條件 從-80℃冰箱中取出保種管，在平板上稀釋涂布，培養(yǎng)7～8 d。挑取單菌落在平板上培養(yǎng)3～4 d，全部洗下并接種于100 mL/500 mL的液體種子培養(yǎng)基中，于220 r·min-1、30℃條件下培養(yǎng)至對數期后，按3.5%(V/V)接種量轉接至擋板搖瓶中，振蕩培養(yǎng)[23]。

1.2.2不同碳氮源搖瓶培養(yǎng)基成分 探究單一碳源和氮源對菌株OD650和PQQ產量的影響。(1)碳源包括：甲醇、乙醇、甘油、葡萄糖，以碳原子濃度0.625 mol·L-1(合甲醇濃度20 g·L-1)為標準設計添加量；(2)氮源包括：硫酸銨、硝酸銨、氨水、蛋白胨，以氮原子濃度0.030 mol·L-1(合硫酸銨濃度2 g·L-1)為標準設計添加量。

1.2.3不同復合碳源和氮源配比設計 設計不同配比復合碳源和氮源，(1)復合碳源∶甲醇和甘油配比為20∶80、40∶60、60∶40、80∶20；(2)復合氮源∶硫酸銨和蛋白胨配比為20∶80、40∶60，60∶40，80∶20。

1.2.4復合碳源和氮源不同添加量的設計 (1)基于甲醇∶甘油(20∶80)的復合碳源，設計該配比下總碳源不同的添加量(5、10、20、30、40 g·L-1；等比換算甲醇濃度)；(2)基于蛋白胨∶硫酸銨(40∶60)的復合氮源，設計該配比下總氮源不同的添加量(1、2、3、4、5 g·L-1；等比換算硫酸銨濃度)。

1.3 測定方法

取樣時間點：48 h前每隔6 h取一次樣，48 h后每隔24 h取1次樣；每次取樣均測OD650，36 h后的樣品采用高效液相色譜儀測PQQ的含量。(1)生物量測定方法：使用紫外可見光分光光度計，在波長650 nm下測定搖瓶菌液吸光光度值OD650，控制OD650范圍在0.2～0.8以內。(2)PQQ含量測定方法：采用高效液相色譜儀對PQQ含量進行檢測[24]。將發(fā)酵液10 000 r·min-1、離心3 min，取上清液用0.22 μm的水系膜過濾。HPLC條件為色譜柱UItimate XB C18 4.6 mm×250 mm(5 μm)。檢測波長330 nm、柱溫40℃、流動相為V(水+1‰ TFA)∶V(乙腈+1‰ TFA)=85∶15、流速為0.5 mL·min-1。

1.4 數據處理

對試驗數據采用Excel軟件進行數據處理和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 單一碳源和單一氮源對菌株OD650和PQQ產量的影響

2.1.1單一碳源對菌株OD650和PQQ產量的影響 由圖1、2可知，以乙醇或葡萄糖為單一碳源時，菌株幾乎不會生長；以甲醇為單一碳源時，菌株在40 h生長至穩(wěn)定期并保持4左右的OD650，隨后大量合成PQQ，在118 h時PQQ產量為43 mg·L-1；以甘油為單一碳源時，菌株在長達50 h延滯期后開始生長，并在118 h OD650達到9.8，但是不生產PQQ。說明甘油的利用需要菌株更長的準備時間，然后優(yōu)先利用碳源于細胞碳骨架的構建以增加OD650。綜合甘油為碳源時菌株的OD650最高和甲醇為碳源時菌株PQQ產量最高，設計以甲醇和甘油復配的復合碳源。

圖1 單一碳源對菌株OD650的影響Fig.1 Effect of the sole carbon source on the OD650 of strain

圖2 單一碳源對菌株PQQ產量的影響Fig.2 Effect of the sole carbon source on the PQQ yield of strain

2.1.2單一氮源對菌株OD650和PQQ產量的影響 由圖3、4可知，以氨水為單一氮源時，菌株幾乎不會生長；以硫酸銨或硝酸銨為單一氮源時，菌株在50 h生長至穩(wěn)定期并保持OD650，隨后在118 h時，PQQ產量分別為29.8、17.0 mg·L-1；以蛋白胨為單一氮源時，菌株前期生長速度更快并在70 h生長至OD650(7.3)的穩(wěn)定期，但是幾乎沒有PQQ的合成。因此，設計以硫酸銨和蛋白胨混合的復合氮源，以期提高前期菌株的生長速度，同時兼顧PQQ的產量。

圖3 單一氮源對菌株OD650的影響Fig.3 Effect of the sole nitrogen source on the OD650 of strain

圖4 單一氮源對菌株PQQ產量的影響Fig.4 Effect of the sole nitrogen source on the PQQ yield of strain

2.2 不同配比復合碳源和復合氮源對菌株OD650和PQQ產量的影響

2.2.1不同配比復合碳源對菌株OD650值的影響 由圖5、6可知，PQQ合成菌株在不同配比的復合碳源培養(yǎng)基中的前期生長速度均高于以甲醇或甘油為單一碳源的培養(yǎng)基，且菌株的最終OD650高于以甲醇為單一碳源的培養(yǎng)基，說明甘油的添加確實可以提高OD650，甘油的比例越高，最終OD650也越高。但只有以甲醇為單一碳源時，可以在120 h檢測到PQQ產量為53 mg·L-1；在其他復合碳源的培養(yǎng)基中，僅有甲醇∶甘油(20∶80)的復合碳源檢測出5 mg·L-1的PQQ產量。上述結果表明，復合碳源可以有效提高OD650，但是干擾了PQQ合成；而以甲醇為單一碳源時，OD650最低，但是PQQ產量最高。為了探討是否因為甘油的加入導致菌株優(yōu)先利用碳源用于自身碳骨架的構建(更高的OD650)，造成PQQ合成途徑碳源供給不足，后續(xù)試驗以甲醇∶甘油為20∶80的比例出發(fā)探討復合碳源不同添加量的影響。

圖5 不同配比復合碳源對OD650的影響Fig.5 Effects of different ratios of composite carbon sources on OD650

圖6 不同配比復合碳源對PQQ產量的影響Fig.6 Effects of different ratios of composite carbon sources on the PQQ yield

2.2.2不同配比復合氮源對菌株OD650和PQQ產量的影響 由圖7、8可知，PQQ合成菌株在不同復合氮源培養(yǎng)基中的前期生長速度均高于以硫酸銨或蛋白胨為單一氮源時的生長速度。其中蛋白胨∶硫酸銨為60∶40或80∶20時，生產菌株在120 h時的OD650分別為8.6和8.5，遠高于同時期以硫酸銨為單一氮源時的OD650(4.3)。從PQQ的合成能力分析，120 h時蛋白胨∶硫酸銨為40∶60的PQQ產量為65 mg·L-1，而同時期下以硫酸銨為單一氮源的PQQ產量僅為42 mg·L-1，其余氮源培養(yǎng)基的PQQ產量均低于上述兩個條件。從生長曲線和PQQ合成產量出發(fā)，探討蛋白胨∶硫酸銨為40∶60配比時不同添加量的影響。

圖7 不同配比復合氮源對OD650的影響Fig.7 Effects of different ratios of composite nitrogen sources on OD650

圖8 不同配比復合氮源對PQQ產量的影響Fig.8 Effects of different ratios of composite nitrogen sources on the PQQ yield

2.3 復合碳源和復合氮源不同添加量對菌株OD650和PQQ的影響

2.3.1復合碳源(甲醇∶甘油=20∶80)不同添加量對菌株OD650和PQQ產量的影響 由圖9、10可知，以甲醇∶甘油為20∶80的復合碳源時，在30 h時，兩個低濃度添加量(5、10 g·L-1)生長明顯延滯，156 h時OD650僅為1.8和3.6，對應的PQQ的產量為17和15 mg·L-1。高濃度添加量(20、30、40 g·L-1)條件下，培養(yǎng)40 h左右生長減緩，大概經過30 h后繼續(xù)生長，添加濃度越高，最終的OD650也越高。濃度40 g·L-1條件下156 h時OD650可達10.8，對應的PQQ產量僅為8 mg·L-1。上述結果表明，添加甘油的復合碳源有利于PQQ生產菌株OD650的增加，且復合碳源的添加量越高， OD650也越高；復合碳源添加量的變化并不能有效提高PQQ產量，說明不是由于碳源不足導致PQQ合成的降低，而是甘油的進入影響了PQQ合成途徑，而且甘油添加濃度越高，對PQQ合成的干擾越大。此外，研究發(fā)現OD650基本穩(wěn)定的菌株PQQ產量高，推測菌株中后期穩(wěn)定的OD650更有利于PQQ的合成。

圖9 復合碳源不同添加量對OD650的影響Fig.9 Effect of different amount of composite carbon sources on OD650

圖10 復合碳源不同添加量對PQQ產量的影響Fig.10 Effect of different amount of composite carbon sources on the PQQ yield

圖11 復合氮源不同添加量對OD650的影響Fig.11 Effect of different amount of composite nitrogen sources on OD650

2.3.2復合氮源(蛋白胨∶硫酸銨=40∶60)不同添加量對菌株OD650和PQQ產量的影響 由圖11、12可知，在以蛋白胨∶硫酸銨為40∶60的復合氮源條件下，復合氮源不同添加量似乎對菌株的生長和PQQ的合成影響很小。濃度1 g·L-1條件下，156 h的OD650為7.3，PQQ產量為11 mg·L-1；其余條件下156 h的OD650為5.5左右，PQQ產量為45 mg·L-1左右。由此推測，在碳源一定的情況下，只要維持基本氮源量，復合氮源的添加量不是影響菌株生長和PQQ合成的關鍵因素。此外，研究發(fā)現OD650波動明顯的菌株PQQ產量最低，推測菌株中后期穩(wěn)定的OD650更有利于PQQ的合成。

圖12 復合氮源不同添加量對PQQ產量的影響Fig.12 Effect of different amount of composite nitrogen sources on the PQQ yield

3 討論與結論

PQQ作為氧化還原酶的輔因子，廣泛應用于醫(yī)藥、化妝品和農業(yè)等領域。目前，PQQ的合成以甲基營養(yǎng)菌發(fā)酵為主，其產量的提高多依靠誘變篩選高性能菌株，缺乏基因工程的介入從而改造菌株實現PQQ產量的大幅提高，究其原因在于這類菌株體內代謝網絡十分復雜，很多相關的代謝途徑至今尚不明確，此外對其限制修飾系統[25]也鮮有研究，從而導致基因操作難度大幅度上升。雖然現在已經有很多條件優(yōu)化[16]來進一步提高PQQ的產量，卻難以實現大幅度的提升。

本研究從最基礎的碳氮源出發(fā)，探討了不同配比碳源和氮源對生絲微菌FJNU-R8生長和PQQ合成的影響。試驗結果表明，以甲醇為單一碳源時PQQ產量最高，但是最終OD650只有4.4，這個結果印證了PQQ是甲醇脫氫酶的輔酶，即在利用甲醇時需要大量的甲醇脫氫酶將甲醇轉化為甲醛，進而進入代謝途徑用于菌株物質和能量的合成，因此菌株需要在較早時期積累PQQ。添加甘油后的復合碳源可以顯著提高最終OD650，但是檢測出PQQ的產量遠低于以甲醇為單一碳源時的PQQ產量，這可能是由于甘油的添加影響了感知甲醇的雙組分系統[26-27]的信號傳遞，從而下調了甲醇脫氫酶甚至PQQ合成基因簇的表達。以硫酸銨為單一氮源時PQQ產量最高，但是最終OD650僅為4.2；添加蛋白胨的復合氮源可以提高菌株生長速度和最終OD650，當蛋白胨∶硫酸銨為40∶60時還可以提高PQQ產量。PQQ的合成與生長的關系為部分偶聯型，在中后期保持穩(wěn)定的OD650更有利于積累PQQ。

本研究發(fā)現甘油的添加可能干擾PQQ的合成，但并非完全阻遏PQQ生產，因此可以只考慮復合碳源提高總OD650，然后選用流加甲醇為單一碳源的方式積累PQQ。值得思考的是，混有甘油的復合碳源利用速度較慢，如何提高甘油的快速利用達到前期快速積累OD650仍需要進一步探究。此外，復合碳源和復合氮源添加量的變化差異很大，如何調整合適的碳氮比使菌株前期專注于生長，中后期專注于PQQ合成值得進一步討論。在未來試驗中，可以進一步篩選合適的復合碳源和氮源并探討相應的添加方式以期獲得更好的發(fā)酵策略，并在發(fā)酵中后期維持發(fā)酵總OD650從而實現PQQ產量的提高。