代謝組學在類風濕關節炎診斷和治療中的研究進展

呂蒙瑩，梁巧玲，羅照勇，倪騰洋，劉延慶

(揚州大學醫學院，轉化醫學研究院，國家中醫藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇 揚州 225001)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種嚴重危害人類健康的慢性自身免疫性疾病，其基本病理特征為滑膜襯里層增生和炎性細胞浸潤(即滑膜炎)[1]。與健康人群相比，RA患者增生的滑膜細胞會與新生微血管形成滑膜血管翳，向關節軟骨內侵襲性生長，形成血管翳/軟骨結合，這一結構是造成RA病人關節破壞，關節畸形，功能障礙的病理基礎。RA發病率約為0.5%～1.0%，任何年齡段均可發病，多見于35～50歲成年人[2]，由于致殘率高且無法完全治愈，給患者及其家庭帶來了沉重的心理和經濟負擔。早診斷、早治療對于預防該疾病進一步發展至關重要，越來越多的學者將代謝組學技術應用于RA的早期診斷、藥物療效預測與評價研究中，現就其研究進展進行綜述。

1 RA代謝組學研究概述

代謝組學(metabolomics/metabonomics)這一概念最初是在20世紀末由Nicholson等[3]提出，是繼基因組學、蛋白組學和轉錄組學之后迅速發展起來的一門新興組學(-omics)學科,它利用現代分析技術，定量研究生物體在不同狀態下(如給藥前后)，所含內源性小分子代謝物(一般指MW<1 000)種類、數量變化的動態規律。代謝組學的研究對象是生物體內參與物質代謝、能量傳遞和信息傳導的全體小分子物質即代謝組(metabolome)，因此其研究步驟主要包括生物樣品預處理(代謝物提取)、數據采集(代謝物檢測)和數據分析(差異代謝物發現)3個部分[4]。

Li等[5]通過文獻調研發現在RA代謝組學研究中，常選用RA患者血清、尿液和滑膜液，雖然滑膜液比血液和尿液更能反映其關節的病理變化，但滑膜液只能從有關節液溢出的RA或骨關節炎(osteoarthritis，OA)患者中獲得，很難從相對應的健康人群中獲取。同樣，關節組織(例如軟骨和骨)樣本也很難從人體中大量獲取。代謝物檢測主要依賴于核磁共振共振技術(1H-,13C-NMR)和基于質譜的液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)、氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)和質譜成像技術(MSI)的快速發展[6]。質譜的主要優勢在于對代謝物的高靈敏度和高覆蓋率快速分析，并且可與多種色譜技術結合實現代謝物的有效分離，而NMR在非破壞性、重復性、定量和結構鑒定等方面具有不可比擬的優勢，因此越來越多的代謝組學研究開始將多種分析技術聯合使用從而極大的拓展了代謝物的檢測范圍，也使檢測結果可以相互印證[7]。代謝物檢測獲得的大量數據需要經過預處理和多元統計分析。數據預處理的目的在于將原始圖譜轉換為數據矩陣并消除或降低實驗操作和儀器分析過程中的誤差，一般分為峰識別、峰匹配與對齊、歸一化、標準化等步驟，其中NMR數據還需要進行峰積分或分段積分。模式識別是代謝組學研究中常用的多變量分析方法，如主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，目前多種軟件或程序語言如SIMCA-P、Unscrambler、Matlab、R等均可實現多變量分析。代謝通路分析可借助人類代謝組HMDB數據庫、代謝通路數據庫(Biocyc)和基于網絡的代謝組學數據處理一體化軟件MetaboAnalyst[4]。

2 代謝組學在RA診斷中的應用

代謝組學的檢測對象是脂質、糖類、氨基酸、有機酸和核酸等內源性小分子代謝物，作為生物體內一系列生化反應的終產物，能夠綜合反映機體在多種因素(如基因，飲食，生活方式等)作用下受疾病侵襲的影響。RA早期臨床癥狀與其他類型關節炎難以區分，而作為一種自身免疫性疾病，早期診斷和治療能有效防止病情惡化，因此發現特異性強、靈敏度高的RA診斷標志物至關重要。

2.1 RA診斷生物標志物Tab 1匯總了代謝組學在RA診斷標志物發現領域的應用。Surowiec等[8]收集了瑞典北部生物庫中RA患者發病前捐獻的血漿樣本，發現RA患者確診前血漿中溶血磷脂酰膽堿(LPCs)、色氨酸相關代謝物以及大部分磷脂和鞘磷脂水平顯著升高。在一項大規模(132名RA患者，104名健康者)RA代謝組學研究中，Yousri等[9]測定了血漿中927個代謝物,發現其中32個代謝物與RA相關，包含了之前報道過的硫酸脫氫異雄甾酮(DHEAS)，皮質醇和雄烯二酮等甾體類代謝物，并且發現皮質類固醇的治療能夠引起這些甾體類代謝物水平的變化。OA和RA是關節炎中最常見的兩種形式，雖然都與年齡相關，但發病機理完全不同，Anderson等[10]發現與OA患者相比，RA患者滑膜液中糖酵解和三羧酸循環相關代謝物含量較低，這與RA患者炎癥反應、滑膜增生和缺氧癥狀更嚴重的情況相吻合，而OA患者滑膜液中牛磺酸含量較高可能與軟骨下骨硬化有關。Dubey等[11]采用基于NMR的代謝組學技術分析RA與反應性關節炎(ReA)患者血清樣本發現，纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸/精氨酸和苯丙氨酸這四組代謝物可作為區分RA與ReA的生物標志物。干燥綜合癥(sjogren’s syndrome,pSS)和RA均為自身免疫性疾病，Li等[13]發現與pSS患者和健康人群相比，3個代謝物(4-甲氧基苯基乙酸，L-亮氨酸，L-苯丙氨酸)可以作為RA的特異性標志物，ROC曲線分析表明這組代謝物的靈敏度為93.30%，特異性為95.2%。

Tab 1 Application of metabolomics in biomarker discovery for RA diagnosis

2.2 區分中醫寒、熱證RA屬于中醫“痹癥”范疇，在中醫證候研究中，多將RA分為寒證(寒濕痹阻證)和熱證(濕熱痹阻證)進行辨證論治。Gu等[14]采用基于LC-MS和GC-MS的代謝組學技術對57例RA患者和23例健康者的血漿標本進行分析，發現RA患者磷酸肌醇、脂質、氨基酸、葡萄糖、抗壞血酸、乙醛酸和二羧酸酯代謝異常，進一步將RA患者分為寒證和熱證后發現，RA熱證患者血漿中甘氨鵝脫氧膽酸鈉、脯氨酸、飽和及單不飽和磷脂酰膽堿濃度高于RA寒證患者，而尿素、游離脂肪酸和多不飽和磷脂酰膽堿含量低于RA寒證患者。Herman等[15]對39例RA患者進行尿液和血漿代謝組學分析及癥狀譜分型，發現寒熱證型RA患者的C-反應蛋白和類風濕因子水平相同，但“關節紅腫”、“關節腫脹”等臨床癥狀顯示兩組患者的炎癥水平存在差異，尿液代謝組學分析結果表明，RA熱證患者的11種酰基肉毒堿水平均高于RA寒證患者，說明寒熱證患者可能在肌肉分解水平上存在差異，RA寒證患者的DHEAS水平相對較低，說明RA寒證患者的下丘腦-垂體-腎上腺軸功能可能受到抑制。Guo等[16]利用基于LC-MS和GC/MS的代謝組學技術，對具有典型中醫寒熱證候的RA患者血漿代謝譜進行了分析，結果表明與健康對照組相比，寒、熱證RA均會引起氨基酸、碳水化合物和脂質代謝物水平的變化，但寒證RA患者具有蛋白質和膠原分解紊亂、糖酵解和有氧氧化降低以及能量代謝加快等特點，可以用于RA寒熱證的區分。

3 代謝組學在RA治療中的應用

3.1 預測藥物治療效果TNF抑制劑是RA治療中常用的生物改善病情抗風濕藥物(biological disease-modifying antirheumatic drugs，bDMARDs)，但仍有1/3的患者對TNF抑制劑治療無效或療效較差，鑒于治療效果的不確定性以及該類藥物昂貴的價格，對TNF抑制劑治療效果的早期預測至關重要，越來越多的組學技術開始應用于TNF抑制劑RA療效預測生物標志物的發現[17]。Priori等[18]采用1H-NMR技術測定了27位女性RA患者在采用依那西普Etanercept治療前及治療6個月后的血清代謝輪廓譜。根據EULAR(European League Against Rheumatism)標準將患者按臨床治療效果分為療效良好、基本有效和無效3組，發現治療前的血清代謝輪廓譜可以區分這三類患者,并且療效良好患者血清中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和葡萄糖水平在治療后顯著升高，而3-羥基丁酸酯水平顯著降低。Sweeney等[19]采用1H-NMR和UPLC-MS/MS技術測定了23位RA患者在原有甲氨蝶呤治療基礎上加入利妥昔單抗Rituximab治療前后的血清代謝輪廓譜，將患者根據6個月后的治療效果分為治療有效者和治療無效者后發現治療有效者在治療前血清中7個極性代謝物和15個脂質代謝物含量與治療無效者相比具有顯著性差異。Dudka等[20]同時采用了1H-NMR,LC-MS和GC-MS技術測定了25位RA患者在采用bDMARDs治療前以及治療3個月后的血漿代謝輪廓，并記錄了治療前及治療3、6、12、18個月后的視覺模擬評分，28處關節疾病活動度評分(DAS 28)和血沉。治療方案包括甲氨蝶呤和3種TNF-α抑制劑(阿達木單抗、依那西普、賽妥珠單抗)或IL-6的單克隆抗體托珠單抗。患者根據治療效果分為治療有效者和治療無效者。對有療效者的劃分是根據EULAR標準，要求DAS28得分在治療后至少下降1.2并且得分低于3.2。代謝組學研究結果表明，治療有效者血漿中24個代謝物在治療后發生了顯著變化，涉及氨基酸、多肽、脂質、維生素等，并發現有療效和無療效者血漿中11個代謝物含量在治療前具有顯著差異，其中N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰神經氨酸在治療后3個月仍具有顯著性差異，進一步ROC曲線分析結果表明這兩個代謝物是預測bDMARDs治療效果的潛在生物標志物。

3.2 探索藥物作用機制雷公藤多苷片作為RA治療中常用的中成藥，在臨床治療方案中常與甲氨蝶呤聯合使用，但其共同作用機制仍不清楚，Wang等[21]對來自中日友好醫院的44名RA患者進行為期12周的甲氨蝶呤和雷公藤多苷片單用或聯用治療，發現雷公藤多苷片與甲氨蝶呤療效相當，但單用組均沒有聯合治療組效果好，進一步采用定量血漿藥物化學和擬靶向代謝作學方法對血漿中7個甲氨蝶呤代謝物、13個雷公藤多苷片主要活性成分和19個內源性差異代謝物進行定量分析，結果表明雷公藤多苷片與甲氨蝶呤聯合治療既沒有增加甲氨蝶呤代謝物引起的藥物毒性，也沒有影響雷公藤多苷片主要活性成分的吸收，并且能夠使RA引起的體內代謝物水平變化恢復正常。為了驗證痹祺膠囊的臨床有效性、安全性和作用機制，Wang等[22]將70位RA患者隨機分為兩組進行為期24周的治療，一組為痹祺膠囊與甲氨蝶呤聯用，一組為來氟米特與甲氨蝶呤聯用，并記錄不同階段的治療效果，發現兩者并無顯著性差異，并且痹祺膠囊組的副反應明顯低于來氟米特組。通過對血清和尿液樣本的代謝組學分析發現痹祺膠囊治療有效的患者尿液中脂肪酸含量豐富而酰基肉毒堿含量降低，表明痹祺膠囊可以使RA患者能量代謝恢復平衡。為探究臨床常用中成藥祖師麻片的作用機制，Shan等[23]采用膠原誘導關節炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型，同時選取血清和糞便樣本進行基于GC-MS的代謝組學研究，發現與對照組相比，CIA模型組大鼠的血清中31個代謝物，糞便中30個代謝物發生了顯著變化，涉及三羧酸循環、糖酵解、脂肪酸和嘌呤代謝，而服用祖師麻片可以使大部分代謝物含量向對照組水平方向變化。進一步對糞便中的短鏈脂肪酸進行含量測定發現祖師麻片可以調節CIA大鼠糞便中丙酸、丁酸和戊酸的水平。清絡飲是治療RA熱癥的常用中藥，Zuo等[24]聯合采用網絡藥理學和代謝組學技術發現清絡飲不僅能減輕CIA大鼠的癥狀，防止關節破壞，還能降低甲氨蝶呤引起的肝損傷和骨髓抑制，這可能與清絡飲能夠引起CIA大鼠體內嘌呤、嘧啶和戊糖磷酸代謝的變化有關。

4 結論與展望

目前代謝組學主要應用于RA的早期診斷、發病機制和藥物療效預測與評價等領域，涉及細胞、動物和臨床生物樣本，其未來主要發展趨勢包括：(1)生物標志物的驗證：雖然RA代謝組學研究已經積累了豐富的實驗數據，但目前仍缺乏對發現的差異代謝物采用不同批次生物樣本進行含量的確證以及采用不同方法進行分析結果的驗證；(2)靶向性和擬靶向性代謝組學分析：在非靶向性代謝組學分析結果的基礎上，針對某一類型的代謝物如脂類(脂質代謝組學)或某一特定代謝通路，參考FDA生物樣品分析的方法學驗證指導原則，建立定量分析方法；(3)與其他組學數據的聯合分析：作為系統生物學的重要組成部分，代謝組學與基因組學、蛋白質組學數據的關聯分析將為RA診斷和治療生物標志物的發現提供新的思路和方法。目前RA的診斷標準主要針對已經出現的癥狀，無法在早期區分不同類型的關節炎性疾病，研究表明早期介入可有效延緩RA進展，因此患者發病前的臨床樣本同樣具有重要研究價值。雖然近年來大量生物制劑應用于RA臨床治療，但昂貴的治療費用以及治療效果的不確定性，常常使患者望而卻步，因此，與基因組學相結合，發現能夠預測抗RA生物制劑療效的代謝標志物意義重大。隨著分析技術的不斷發展以及代謝組學分析流程的日益規范化，RA代謝組學研究將為RA的診斷和治療提供重要參考價值。