黃芪甲苷對(duì)射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭大鼠心臟功能保護(hù)及心肌微血管炎癥因子的影響*

崔梁瑜 馬 靜 張學(xué)學(xué) 薛松研 王方圓 許 航 張 莎

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032）

資料顯示，我國(guó)心力衰竭（HF）粗發(fā)病率為0.87/1 000人年，累積發(fā)病率為0.86%［1］。其中約有50%HF患者為射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭（HFpEF）［2］。西醫(yī)主要針對(duì)癥狀、心血管基礎(chǔ)疾病和合并癥、心血管疾病危險(xiǎn)因素進(jìn)行治療［3］，但目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可明顯改善HFpEF患者治療結(jié)果的方法，因此尋找針對(duì)HFpEF更有效安全的治療藥物，仍是心血管疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。中醫(yī)藥治療具有多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，可以改善HFpEF的癥狀。研究顯示［4-5］，黃芪中的黃芪甲苷（AstragalosideⅣ）對(duì)HF有改善作用，可以促進(jìn)血管生成、改善能量代謝、抑制心肌肥大、凋亡及纖維化，但能否改善HFpEF心臟功能尚未明確。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察黃芪甲苷對(duì)HFpEF模型大鼠的心臟功能保護(hù)及其作用機(jī)制，為HFpEF的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)雄性鹽敏感（Dahl-ss）大鼠25只，體質(zhì)量（200±20）g，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替，室內(nèi)溫度控制在18～22℃，濕度控制在50%～60%，食物和水自由攝取。

1.2 試藥與儀器 黃芪甲苷（規(guī)格：60 g，純度：99.61%，中國(guó)Rskbio公司），加入去離子水?dāng)嚢杈鶆颍渲脼橘|(zhì)量濃度2.5 g/mL藥液，4℃冰箱冷藏備用。蘇木素染色液（中國(guó)Beyotime公司）；NT-ProBNP ELISA試劑盒（美國(guó)Cloud-Clone公司）；vWF抗體（Thermo Fisher Scientific公司）；VEGF、CD31、TNF-α和 IL-6抗體（美國(guó)Sigma公司）；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（美國(guó)Sigma公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：EPOCH2，美國(guó)BioTek公司）；正置熒光顯微鏡（型號(hào)：Axioimager M1，德國(guó)CarlZeiss公司）；心電圖機(jī)（型號(hào)：Osciloscopio DS6064，美國(guó)ADInstruments公司）；彩色多普勒超聲（型號(hào)：IU22，荷蘭Phlips公司）。

1.3 分組與造模 將25只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組及黃芪甲苷低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組［6-7］，每組5只。正常對(duì)照組用0.3%NaCl飼料喂養(yǎng)8周，其余各組采用8%NaCl高鹽飼料喂養(yǎng)8周進(jìn)行HFpEF模型制備。當(dāng)LVEF≥50%，BNP＞100 pg/mL，NT-ProBNP＞300 pg/mL，心率增快，提示模型制備成功。

1.4 給藥方法 HFpEF模型制備成功后，黃芪甲苷低、中、高劑量組分別按黃芪甲苷10、20、40 mg/kg灌胃8周。正常對(duì)照組、模型組灌胃等量蒸餾水。

1.5 心電圖檢查 于末次灌胃24 h后，麻醉大鼠并固定于鼠板上，連接心電圖機(jī)，心率穩(wěn)定3 min后記錄心電圖。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）ELISA法檢測(cè)NT-ProBNP：心電圖記錄完畢后，大鼠開(kāi)胸取血，抽取血液5 mL，離心取上清，96孔板中分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液后，加血清50 μL/孔，采用ELISA法檢測(cè)NT-ProBNP含量。2）免疫熒光染色：取出完整心臟，心肌組織脫水、浸蠟和包埋，切片厚度為5 μm，脫蠟，滴加山羊血清封閉后PBS沖洗，依次加入一抗（vWF抗體、CD31抗體）、生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）后封片，檢測(cè)心臟組織CD31、vWF表達(dá)。3）免疫組化染色：心肌組織切片脫蠟，PBS沖洗以后，加抗原修復(fù)液，低火加熱，PBS沖洗，內(nèi)源酶滅活，采用3%的H2O2室溫避光孵育，PBS沖洗，依次加入一抗（VEGF抗體、TNF-α抗體和IL-6抗體）、生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，PBS沖洗；DAB顯影，蘇木素染色液復(fù)染，脫水，透明，封片，檢測(cè)VEGF、TNF-α和IL-6。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，各個(gè)組間進(jìn)行比較時(shí)采取單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲心動(dòng)指標(biāo)比較 見(jiàn)圖1，表1。模型組大鼠較正常對(duì)照組大鼠LVEF值降低，舒張期室間隔厚度（IVSd）值升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）和左室后壁舒張期厚度（LVPWd）值差異不明顯（P＞0.05）。與模型組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量大鼠LVEF值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中、高劑量組IVSd顯著降低（P＜0.05）；LVIDd和LVPWd值差異不明顯（P＞0.05）。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠超聲心電圖

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)指標(biāo)比較（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與黃芪甲苷低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與黃芪甲苷中劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

組 別n LVEF（%）IVSd（mm）LVIDd（mm）LVPWd（mm）5 5 5 5 5正常對(duì)照組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷中劑量組黃芪甲苷高劑量組76.10±2.92*53.81±2.84 61.71±5.82*68.50±2.79*△72.58±4.38*△1.83±0.02*2.15±0.06 2.32±0.46 1.99±0.03*1.91±0.03*▲▲7.69±0.46 7.88±0.71 7.76±0.16 7.98±0.08△7.87±0.57 1.90±0.04 2.02±0.08 2.03±0.16 2.03±0.15 2.11±0.12

2.2 各組大鼠血清NT-ProBNP水平比較 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清NT-ProBNP顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組大鼠血清NT-ProBNP均有不同程度的降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清NT-ProBNP表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清NT-ProBNP表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

組別正常對(duì)照組模型組黃芪甲苷低劑量組黃芪甲苷中劑量組黃芪甲苷高劑量組n5 5 5 5 5 NT-ProBNP 123.13±9.30*373.77±13.61 305.70±19.17*236.10±18.39*△△155.20±21.00*△△▲▲

2.3 各組大鼠心臟組織CD31表達(dá)比較 見(jiàn)圖2，表3。各組大鼠心肌組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞均可見(jiàn)綠色CD31表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，模型組CD31表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組CD31表達(dá)增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠心肌組織CD31、vWF熒光表達(dá)量比較（%，±s）

表3 各組大鼠心肌組織CD31、vWF熒光表達(dá)量比較（%，±s）

組別正常對(duì)照組模型組黃芪甲苷高劑量組n5 5 5 CD31 13.10±0.50**4.99±0.60 10.62±1.80*vWF 2.65±0.29**13.04±0.47 4.39±0.82*

圖2 各組大鼠心肌組織的CD31熒光染色（400倍）

2.4 各組大鼠心臟組織vWF表達(dá)比較 見(jiàn)圖3，表3。大鼠心肌組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)綠色血管性血友病因子（vWF）的陽(yáng)性表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，模型組vWF陽(yáng)性表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組vWF的陽(yáng)性表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠心肌組織的vWF免疫熒光染色（400倍）

2.5 各組大鼠心臟組織VEGF表達(dá)比較 見(jiàn)圖4，表4。各組大鼠心肌組織微血管壁周圍可見(jiàn)VEGF蛋白表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，模型組黃褐色顆粒顯著減少，VEGF表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組VEGF的蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織的VEGF表達(dá)（免疫組化染色，400倍）

表4 各組大鼠心肌組織VEGF、TNF-α、IL-6表達(dá)比較（%，±s）

表4 各組大鼠心肌組織VEGF、TNF-α、IL-6表達(dá)比較（%，±s）

組別正常對(duì)照組模型組黃芪甲苷高劑量組n5 5 5 VEGF 10.57±0.63*4.85±0.11 7.78±0.24*TNF-α 2.03±0.17**5.11±0.16 2.93±0.30**IL-6 3.10±0.25*6.15±0.22 3.18±0.59*

2.6 各組大鼠心臟組織中TNF-α和IL-6表達(dá)比較 見(jiàn)圖5，表4。各組大鼠心肌組織中內(nèi)皮細(xì)胞周圍均可見(jiàn)少量TNF-α、IL-6表達(dá)（黃褐色顆粒）。與正常對(duì)照相比，模型組TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組TNF-α、IL-6表達(dá)減少（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠心肌組織的TNF-α、IL-6表達(dá)（免疫組化染色，400倍）

3 討 論

HFpEF發(fā)病率日益升高，且在一項(xiàng)急性失代償性心力衰竭（ADHF）患者的抽樣實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ADHF住院趨勢(shì)增加主要由HFpEF引起［8］，以ACEI、ARB為代表的西藥雖然具有血管保護(hù)作用，但多項(xiàng)薈萃分析顯示對(duì)HFpEF預(yù)后沒(méi)有明顯改善［9］。因此探索中醫(yī)藥治療，為HFpEF治療提供更多思路具有重要意義。根據(jù)臨床表現(xiàn)，HFpEF屬于中醫(yī)學(xué)的“心悸”“水腫”等范疇，主要病機(jī)為氣虛水停［10］，治療多用“補(bǔ)氣利水”之法。中藥黃芪有補(bǔ)氣固表、利尿生肌功效，可以改善HF癥狀，主要成分黃芪苷中黃芪甲苷生物學(xué)活性最好。黃芪甲苷具有促進(jìn)血管生成、抑制心肌肥厚和纖維化等作用［11］，但對(duì)于HFpEF的心臟保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。

高鹽攝入引起的高血壓誘發(fā)全身性氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致IL-6和TNF-α升高，在HFpEF患者的橫斷面研究中表達(dá)增多［12］。TNF-α和IL-6可抑制心肌細(xì)胞收縮，誘導(dǎo)炎癥激活，引起微血管炎癥和功能障礙。TNF-α通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶2（COX-2）增加血管通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用［13］；IL-6發(fā)揮負(fù)性肌力作用，通過(guò)gp130/STAT3途徑促進(jìn)心肌細(xì)胞肥厚［14］，導(dǎo)致組織損傷和心臟功能障礙。全身性炎癥狀態(tài)影響冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮功能，HFpEF患者心肌活檢樣品中觀察到的血管細(xì)胞黏附分子（VCAM）和E-選擇素高表達(dá)為此提供證據(jù)［15］。vWF作為炎癥的標(biāo)志，是血管內(nèi)皮標(biāo)志物，也是血管功能障礙的指標(biāo)。在一項(xiàng)HFpEF患者10年的長(zhǎng)期隨訪實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，vWF是HFpEF患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物［16］。黃芪甲苷通過(guò)激活自噬，減輕心肌肥大，減少炎癥實(shí)現(xiàn)心臟保護(hù)作用，可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥和凝血介質(zhì)的表達(dá)［17］。在一項(xiàng)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以有效抑制主動(dòng)脈中 IL-1β、IL-6、TNF-α 的 mRNA 表達(dá)［18］。CD31位于中性粒細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的連接處，參與血管生成，是血管內(nèi)皮細(xì)胞主要標(biāo)志物之一，是反應(yīng)側(cè)支循環(huán)的最可靠指標(biāo)［19］。VEGF在內(nèi)皮生成中至關(guān)重要，通過(guò)VEGF R1/R2發(fā)出的典型VEGF信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)幾種酶的活性，最終參與血管生成過(guò)程。Lin Li等［20］發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過(guò)PPARγ依賴性方式將巨噬細(xì)胞從M1轉(zhuǎn)化為M2表型，或激活PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)心肌梗死后的血管生成和心臟保護(hù)，促進(jìn)血管生成，增加VEGF的蛋白質(zhì)表達(dá)。

冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮在全身炎癥狀態(tài)下產(chǎn)生活性氧（ROS），從而限制臨近心肌細(xì)胞的一氧化氮（NO）生物利用度，導(dǎo)致心肌細(xì)胞中蛋白激酶G（PKG）活性降低。PKG活性降低導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，左心室重塑，且由于細(xì)胞骨架蛋白低磷酸化使心肌細(xì)胞僵硬。心肌細(xì)胞僵硬和成纖維細(xì)胞增加引起膠原蛋白沉積，從而引起HFpEF舒張功能障礙［21］。

本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠較正常對(duì)照組LVEF值明顯降低，但仍大于50%，收縮功能未受到明顯影響，黃芪甲苷低、中、高劑量組與模型組相比，IVSd降低，說(shuō)明黃芪甲苷可以改善心肌收縮功能、減輕心肌肥厚。黃芪甲苷低、中、高劑量組較模型組血清BNP和NT-ProBNP降低，心肌細(xì)胞排列較整齊，血管壁結(jié)構(gòu)完整規(guī)則，提示黃芪甲苷對(duì)心臟功能有保護(hù)作用，且黃芪甲苷高劑量組大鼠與模型組相比，vWF的陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，說(shuō)明黃芪甲苷可以改善心臟內(nèi)皮細(xì)胞功能，能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷以后誘發(fā)的一系列反應(yīng)，有效緩解心臟微循環(huán)障礙，減緩HFpEF的進(jìn)一步發(fā)展，改善HFpEF預(yù)后。與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組的TNF-α和IL-6蛋白呈現(xiàn)不同程度的下降，說(shuō)明黃芪甲苷能夠減少炎癥發(fā)生，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，減緩HFpEF的發(fā)展進(jìn)程。與模型組相比，黃芪甲苷高劑量組的VEGF蛋白增多，表明高劑量黃芪甲苷能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，減緩HFpEF的發(fā)展進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃芪甲苷對(duì)HFpEF模型大鼠的心臟功能具有保護(hù)作用，為HFpEF的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。黃芪甲苷高劑量組與模型組比較，結(jié)果提示黃芪甲苷對(duì)HFpEF模型大鼠心臟保護(hù)功能可能與抑制心肌組織炎性反應(yīng)、改善心肌微血管功能和心肌損傷有關(guān)，但因HFpEF疾病本身異質(zhì)性，相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

圖6 實(shí)驗(yàn)機(jī)制圖