參附注射液有效成分治療急性心肌梗死作用機制的網絡藥理學研究*

藍 洲 陀 鵬 梁鐙月 朱冬玲 韋宜賓 鄧海霞 趙 旋（廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021）

急性心肌梗死（AMI）的病理生理機制主要是因冠脈嚴重狹窄或易損斑塊的破裂而導致的急性血栓形成，或伴有血管收縮劑微血管栓塞，引起心肌缺血壞死。因其住院率及死亡率呈同比上升趨勢，且預后差，已嚴重威脅我國民眾健康［1］。因此，早期發現易損斑塊并進行藥物或器械等預防性治療是預防AMI的關鍵措施［2］。目前，進行緊急經皮冠狀動脈介入治療（PCI）及溶栓是治療AMI的主要有效手段，最大限度地提高再灌注療效，但治療費用頗高，且存在較多的并發癥，如急性心力衰竭、交感風暴等，尤其在出院后長期的預防用藥及心臟康復治療更給社會及家庭帶來沉重的經濟負擔。故目前尋求有效的藥物防治AMI仍是難以攻克的問題。AMI屬于中醫學心系病證中“真心痛”范疇，其發病基礎是本虛，標實是發病條件，臨床上以寒凝心脈證、正虛陽脫證為常見，故通常選用溫補心陽、回陽救逆、益氣固脫之方藥進行干預，研究證實能取得較好的臨床療效［3-4］。目前，由紅參、附子提取制作而成的參附注射液（SFI）具有很好的臨床應用價值，且安全性能好，其主要生物活性源于人參皂苷及多類生物堿成分，兩者相輔相成，共同發揮藥物療效。多項研究表明，SFI可發揮抑制細胞凋亡、調節免疫等作用，對心肌細胞起保護作用，可明顯減輕心臟血管的再灌注損傷［5-6］。在AMI中，使用SFI得以補益陽氣、溫振心陽，從而達到治療目的［7］。本研究采用網絡藥理學方法探討SFI主要生物成分治療AMI的作用機制，旨在為進一步的實驗研究和臨床應用提供思路。

1 資料與方法

1.1 SFI有效成分獲取 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）對SFI中所含中藥（紅參、附子）進行檢索，以生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18為標準進行篩選，其中OB是指中藥被吸收入人體循環的速度與程度，OB＞30%表示有效；DL指化合物與已知藥物的相似性，從而確定藥物的某種化合物是作用于人體的［8］。得到符合標準的成分（Ingredients）和相關靶點（Related Targets），進而得到藥物有效成分及靶點的信息表格圖。

1.2 AMI與SFI對應分子靶標的獲取 通過Gene-Cards數據庫（https//www.genecards.org）及在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）（https：//www.omim.org），以“AMI”為關鍵詞，采用Cytoscape 3.6.1軟件，檢索得到疾病的靶點，采用ActivePerl軟件、venny.R、Java插件、R軟件、UltraEdit等軟件分析，得到藥物靶點和疾病靶點交集部分，找出藥物對應疾病的關鍵靶點，構建疾病與藥物文恩圖，此處文恩圖指SFI有效成分中所對應的靶點與AMI靶點相互交集的關系圖，并將其可視化。

1.3 AMI與SFI的蛋白互作網絡圖及核心基因構建 利用SRTING數據庫（https：//string-db.org），復制并輸入疾病與藥物相交集的靶基因，以“Homo sapiens”作為檢索條件，隱藏無關系的游離點，繪制出疾病與藥物間蛋白互作網絡圖，并高清輸出，統計并分析疾病與藥物基因蛋白之間的連線關系（基因蛋白間連線越多，則說明該基因蛋白在疾病與藥物關系中所起的作用越關鍵）。

1.4 基因本體生物學過程（GO-BP）富集分析及基因組百科全書（KEGG）通路分析 將疾病與藥物相交集的33個基因名字轉化為基因的ID，在R軟件中安裝citation（“DOSE”）、citation（“clusterProfiler”）、citation（“pathview”）等相應的軟件包，修改相應的公眾目錄，運行并構成的網絡圖進行GO功能富集分析及KEGG的通路富集分析，以統計學P＜0.05為條件進行過濾，通過此步驟明確SFI是通過調節人體的何種功能或通路來達到治療AMI的目的。

2 結 果

2.1 SFI中有效成分 通過TCMSP數據庫進行檢索，以OB＞30%、DL＞0.18作為篩選標準，得到SFI有效成分共24個。有效成分包括谷甾醇（sitosterol）、次烏頭堿（hypaconitine）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、人參皂苷rh2（ginsenoside rh2）等，見表1。

表1 SFI中有效成分

2.2“SFI有效成分-靶點-AMI”文恩圖 見圖1。利用GeneCards數據庫及OMIM數據庫，以“AMI”為檢索關鍵詞，得到疾病的靶點共3 341個，如白細胞介素-6（IL-6）、FMS樣的酪氨酸激酶3（FLT3）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白p53（TP53）、非受體型酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、白細胞介素-10（IL-10）等，兩者取交集后獲得藥物成分疾病共同核心靶點33個，以文恩圖形式展現，其中藍色區域代表Disease（疾病-AMI），紅色區域代表Drug（藥物-SFI），暗紅色區域代表疾病與藥物相交集的核心靶點。

圖1 “SFI有效成分-靶點-AMI”文恩圖

2.3 SFI與AMI的蛋白互作網絡圖構建 見圖2。利用SRTING數據（https：//string-db.org），復制并輸入疾病與藥物相交集的靶點，即文恩圖中兩者相交集的33個靶點，以“Homo sapiens”作為檢索條件，去掉游離無作用的單個蛋白靶點，在線網絡生成SFI與AMI的蛋白互作網絡圖。由蛋白互作網絡圖可以得出，AMI與SFI關系較為緊密的蛋白分子有半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶 3（CASP3）、白細胞介素-1β（IL-1β）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶8（CASP8）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1（CASP1）等。紫色連線表明PTGS2與CASP1、CASP3之間具有實驗論證的證據。JUN與CASP9既存在融合關系，也具有共表達關系。由此，筆者可以預測JUN、CASP3、IL-1β、CASP8、PTGS2等可能是SFI治療AMI的核心潛在靶點蛋白。

圖2 “AMI-SFI”蛋白互作網絡圖

2.4 SFI中有效成分及靶點蛋白治療AMI的GO功能富集分析 見圖3。根據GO富集分析柱狀圖可知，筆者得到功能富集數目較多的活性物質共20個，顏色的不同表明不同的富集關系，其中功能富集受體活動較強的5個是：G protein-coupled amine receptor activity（G蛋白偶聯的胺受體活性）、G protein-coupled neurotransmitter receptor activity（G蛋白偶聯的神經遞質受體活性）、postsynaptic neurotransmitter receptor activity（突觸后神經遞質受體活性）、acetylcholine receptor activity（乙酰膽堿受體活性）以及steroid hormone receptor activity（類固醇激素受體活性）。由此，筆者可預測SFI可能通過以上富集活性較強的受體，起到對AMI的干預作用。

圖3 SFI-AMI的GO功能富集柱狀圖

2.5 SFI中有效成分及靶點蛋白治療AMI的KEGG的通路富集分析 見圖4～圖5。由圖4可以統計總共有20條相關通路，根據富集的程度，IL-17 signaling pathway（IL-17信號通路）、TNF signaling pathway（TNF信號通路）、C-type lectin receptor signaling pathway（C型凝集素受體信號通路）、p53 signaling pathway（p53信號通路）、Calcium signaling pathway（鈣信號通路）、Toll-like receptor signaling pathway（Toll樣受體信號通路）、NOD-like receptor signaling pathway（NOD樣受體信號通路）、cAMP signaling pathway（cAMP信號通路）等通路在SFI治療AMI過程中關聯密切，同時與Lipid and atherosclerosis（脂質和動脈粥樣硬化）、Hepatitis B（乙型肝炎）、Influenza A（甲型流感）、Measles（麻疹）等疾病存在關系。此外，筆者根據圖4中IL-17信號通路預測，IL-17E生成因子可能通過上調或下調某些細胞分子，誘發細胞凋亡，在DNA中表達成th2相關細胞因子或趨化因子，從而誘導th2細胞反應或抑制th17細胞反應，達到調控目的。

圖4 SFI-AMI的KEGG氣泡圖

圖5 IL-17信號通路圖

3 討 論

對于AMI來說，粥樣硬化斑塊破裂或糜爛所致的急性血栓形成，是最常見的發病原因。易損斑塊主要以纖維帽較薄、脂核大、富含炎癥細胞和組織因子為形態學特點，斑塊破裂則與體內的炎癥細胞、淋巴細胞分泌的蛋白酶相關。目前，多項研究表明，已知SFI中的有效成分對心肌細胞缺血缺氧具有保護機制［9-11］。本研究中筆者通過網絡藥理學的方法，檢索得到參附注射液的主要有效成分，如β-谷固醇、人參皂苷rh2、芥子堿、谷甾醇、羥乙炔等。其中，β-谷甾醇廣泛存在于天然植物中，通過對β-谷固醇酯化反應獲得了4種新的衍生物，發現其衍生物可大大提高抗氧化酶的活性，降低了腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β和IL-6的水平，證實了其衍生物可對抗由TLR4和Nrf2途徑介導的LPS/GalN誘導的急性肝損傷，有抗干細胞損傷作用［12］。芥子堿不僅是一種非常有價值的天然抗氧化劑，還具有顯著的抗氧化、降血壓、抗炎等多種生物活性功能。筆者通過檢索相關中外文獻，發現人參皂苷rh2廣泛用于抗腫瘤、抗心肌缺血、調節免疫功能等方面。邵懇等通過對大鼠分組進行實驗，發現人參皂苷Rh2可改善高脂大鼠氧化應激與炎癥水平，增加大鼠心肌缺血再灌注后外周血EPCs數量，從而保護受損心肌［13］。同時，筆者發現SFI可能通過關系較為緊密的JUN、CASP3、IL1B、CASP8、PTGS2等蛋白分子，達到治療AMI的療效。吳林慧等通過實驗表明，Casp3可促進Jun的表達，達到抑制腎癌細胞的增殖，加快癌細胞凋亡的作用［14］。Caspase-3是一種蛋白酶，一般認為Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細胞殺傷機制的重要組成部分。Riedel等發現體內尿酸對CASP3的不可逆轉抑制，可減少肝細胞凋亡［15］。CARD8和IL-1B多態應激反應可治療新生兒體溫過低的缺氧缺血性腦病［16］。此外，在GO功能富集分析上得出在SFI治療AMI中主要的蛋白活性受體，其中，G蛋白偶聯的胺受體活性具有自主神經系統的調節的功能，在AMI發病過程中，心肌耗氧量的增加以及心肌氧釋放的減少，如心跳加速、疼痛、發熱、低血壓等，均會導致心絞痛惡化加重或心源性休克。Katie發現腎上腺G蛋白偶聯受體激酶2在心力衰竭中交感神經系統中具有調節作用［17］。研究發現，α7nACh受體激動劑可上調心肌細胞p-GSK-3βSer9蛋白表達，而p-NF-κB p65 Ser536蛋白表達下調，具有降低GSK-3β活性抑制炎性反應，從而減輕大鼠心肌細胞缺氧復氧損傷［18］。

在KEGG的通路富集圖中筆者得到20條富集程度較高的通路。圖5顯示IL-17信號通路家族包含IL-17E、IL-17A、IL-17C等，此外，其受體家族包括IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC等。2017年蘇靜麗等提出抑制IL-17可能是治療心肌缺血再灌注損傷的新型治療靶向通路［19］。而今，多項研究已證實，IL-17與多個器官缺血再灌注損傷的發病機制有關，尤其在心肌再灌注損傷中具有很好的抗缺血作用。郭梅等采用IL-17A對小鼠冠脈進行實驗，發現不同濃度IL-17A能夠促進原代心肌細胞凋亡，誘導Caspase-3、Bax表達，抑制Bcl-2及PI3K/Akt通路蛋白表達，起到保護心肌細胞的作用［20］。另有研究發現，心肌梗死后，IL-17A、IL-17F和IL-17受體的表達均升高，表明在心肌缺血再灌注損傷期間IL-17細胞因子及其受體的表達升高，IL-17可增強心肌梗死期間的心肌嗜中性粒細胞募集，促進梗死后的炎性反應和凋亡反應［21-22］。由此，筆者預測在治療AMI中，SFI可能靶向作用IL-17細胞因子或其家庭細胞因子，通過上調或下調作用誘發細胞凋亡，從而改善急性心肌梗死中心肌細胞的缺血缺氧。此外，筆者還發現TNF、C型凝集素受體及p53等信號通路與AMI、SFI同樣具有密切關聯，值得深入探索。

綜上所述，SFI中的有效成分在治療AMI中起重要角色作用，可調節相關細胞因子，與抗缺血缺氧、抑制凋亡和炎癥反應等多個靶向通路聯系密切。本研究為SFI治療AMI的進一步臨床試驗研究提供了網絡藥理學理論基礎，但其具體靶向分子作用機制需進行深入研究。