高原鼠兔對極端低氧環(huán)境的生理、行為和分子生物學(xué)適應(yīng)研究進(jìn)展

齊麗紅 鄒登朗 祁得勝 劉忠浩 馬建濱 都玉蓉

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海省青藏高原生物多樣性形成機(jī)制與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧，810008)

在高原環(huán)境中，隨著海拔的升高，氧濃度隨之降低。當(dāng)人類從平原進(jìn)入高原環(huán)境時，高海拔迫使人體降低動脈血氧分壓和血氧飽和度，最終導(dǎo)致組織和器官缺氧。反過來，出現(xiàn)急性高海拔缺氧或輕度高原反應(yīng)，都會影響體內(nèi)物質(zhì)的代謝并阻礙正常的身體功能，可能導(dǎo)致高海拔肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)和高海拔腦水腫(high altitude cerebraledema，HACE)，而慢性高海拔缺氧會導(dǎo)致紅細(xì)胞增多癥和心血管疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在海拔3 000～5 000 m時，氧氣體積分?jǐn)?shù)僅為平原的60%，此時會使機(jī)體處于缺氧狀態(tài)。當(dāng)處于缺氧狀態(tài)時，機(jī)體會產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理變化來適應(yīng)缺氧[2]。低氧適應(yīng)是機(jī)體應(yīng)對極端環(huán)境的保護(hù)性機(jī)制，指生物體進(jìn)入低氧環(huán)境后，通過自身調(diào)節(jié)，最終達(dá)到一種新的動態(tài)平衡的過程[3]。青藏高原具有十分獨(dú)特的氣候和地理環(huán)境，如缺氧、寒冷、強(qiáng)紫外線等，而低氧是高原最明顯的氣候特征，對動物的生存有著深遠(yuǎn)的影響。經(jīng)過長期的進(jìn)化適應(yīng)，許多高原土著動物已經(jīng)形成了自己獨(dú)特的適應(yīng)高原環(huán)境的機(jī)制[4]。

高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)屬兔形目(Lagomorpha)，鼠兔科(Ochotonidae)，鼠兔屬，是生活在青藏高原海拔3 000～5 000 m的特有種[5]。高原缺氧是青藏高原明顯的非生物脅迫源，研究發(fā)現(xiàn)，青藏高原高海拔地區(qū)動物已經(jīng)發(fā)展出獨(dú)特的心血管、血液和呼吸系統(tǒng)，以確保適應(yīng)惡劣的環(huán)境[6]。在許多高原哺乳動物中，通過增加微血管密度、增加紅細(xì)胞數(shù)目和減弱低氧性肺血管收縮反應(yīng)來適應(yīng)高原缺氧[7-8]。筆者在馬蘭等[9]對高原鼠兔低氧基因研究的基礎(chǔ)上，對高原鼠兔低氧適應(yīng)的生理機(jī)制和分子機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步闡述。

1 生理學(xué)適應(yīng)

在長期的進(jìn)化過程中，高原鼠兔的組織器官為適應(yīng)低氧環(huán)境而產(chǎn)生了一系列的變化。鼠兔的肺組織中毛細(xì)血管豐富，血管壁薄，有利于氣體交換，保證機(jī)體的正常需氧量。在低氧環(huán)境中，鼠兔的心臟不會出現(xiàn)肥厚現(xiàn)象，避免了長期低氧對心臟的損傷。

1.1 血液學(xué)特征

高原鼠兔因長期在高原環(huán)境下生存，能夠很好地適應(yīng)低氧環(huán)境。在血液學(xué)方面，表現(xiàn)為血液與血紅蛋白(hemoglobin，Hb)的結(jié)合、釋放氧的能力較高，這對低氧時體內(nèi)氧的傳遞是有利的。有研究表明，高原鼠兔在低氧條件下的適應(yīng)表現(xiàn)為氧解離曲線(oxygen dissociation curve，ODC)左移，即血紅蛋白與氧結(jié)合能力增強(qiáng)，而氧解離曲線中段較陡的部分可以說明它有利于氧在肺部的運(yùn)輸與釋放，便于組織臟器獲取更多的氧[10]。P50值變小、紅細(xì)胞氧解離能力增強(qiáng)。高原鼠兔紅細(xì)胞的共同特征是低血紅蛋白、低血細(xì)胞比容(hematocrit，HT)和低平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume，MCV)，這一特征使得高原鼠兔血液在肺部進(jìn)行氣體交換的紅細(xì)胞的表面積增大，利于紅細(xì)胞攜氧運(yùn)輸。血液中的HT和MCV降低時，對血液黏度、血液循環(huán)阻力都有舒緩作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，高原鼠兔的動脈血與靜脈血的血氧飽和度差顯著高于SD大鼠，表明高原鼠兔的血氧利用率更高[10]。

1.2 肺組織

高原鼠兔肺泡內(nèi)有大量的彈性纖維[14]，并有由內(nèi)皮細(xì)胞組成的豐富毛細(xì)血管，且管壁薄。鼠兔的肺小動脈壁缺少平滑肌層而變得非常薄，直徑100 μm以內(nèi)的肺小動脈壁僅由一層彈力纖維組成[15]。薄的肺小動脈壁有利于在低氧條件下進(jìn)行氣體交換，使更多的氧進(jìn)入肺部，從而保證其在低氧環(huán)境中處于正常氧狀態(tài)，更好地適應(yīng)低氧環(huán)境。

1.3 心臟

人類和動物長期處在高海拔環(huán)境中會導(dǎo)致適應(yīng)性的心肺變化，以維持缺氧條件下組織的氧氣輸送。人類在適應(yīng)高原環(huán)境過程中，會通過心房起搏增加最大心率(maximal heart rate，HRmax)，這會使β-腎上腺素能受體脫敏，長期缺氧的大鼠心肌β-腎上腺素受體的密度會降低。因此，一種可能的低氧適應(yīng)機(jī)制是β-腎上腺素能受體脫敏反應(yīng)，以降低最大心率而對心臟缺氧進(jìn)行保護(hù)[16]。高原鼠兔通過抑制腎上腺素基因的表達(dá)，來降低腎上腺素的濃度，從而降低心臟的工作速度，避免長期低氧對心臟的損傷，從而更好地適應(yīng)低氧環(huán)境。且高原鼠兔長期適應(yīng)低氧環(huán)境顯示出更高的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA表達(dá)，表明其通過VEGF途徑促進(jìn)心臟血管生成[17]。

2 行為學(xué)適應(yīng)

高原鼠兔在不同的低氧環(huán)境下存在不同的繁殖對策，說明高原鼠兔在長期的低氧進(jìn)化過程中產(chǎn)生了繁殖上的適應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，高原鼠兔在不同的海拔高度下的繁殖對策存在顯著差異。處于低海拔地區(qū)的高原鼠兔每年繁殖2～3次，胎仔數(shù)為(4.5±0.1)，在氣溫回升的暖季月平均存活率為23.4%～28.6%[18]；處于高海拔地區(qū)的高原鼠兔每年繁殖1～2次，胎仔數(shù)為(3.2±0.1)，暖季月平均存活率為33.5%～50.3%[19-20]。海拔越高，氧氣越稀薄，溫度越低，食物越少。為了減少自身消耗，更好地適應(yīng)高海拔環(huán)境，高原鼠兔在高海拔地區(qū)的繁殖次數(shù)明顯減少。同時，為了提高種群密度，高原鼠兔通過增加胎仔數(shù)和存活率來更好地適應(yīng)低氧、低溫、食物少的環(huán)境。

3 分子生物學(xué)適應(yīng)

3.1 血管生成

VEGF廣泛存在于動物體的各個組織中，在血管生成、血管重塑、組織缺氧過程中發(fā)揮著重要作用。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞上的一種特異性結(jié)合蛋白，是調(diào)節(jié)細(xì)胞和血管的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是唯一能誘導(dǎo)血管特異性生成的蛋白[21]。VEGF具有降低動脈壓的作用，低氧刺激下可使體內(nèi)VEGF表達(dá)量增高，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管的生成，同時使血管通透性增加，使更多的氧氣進(jìn)入組織。VEGF還可以增加心率和心輸出量，但VEGF的表達(dá)不會對心肌力收縮產(chǎn)生影響，卻可以通過增加血管通透性來降低血管外周阻力[22-23]。VEGF165和VEGF189在高原鼠兔體內(nèi)顯示出組織和海拔的特異性表達(dá)模式。對高原鼠兔的VEGF165和VEGF189亞型克隆分析，發(fā)現(xiàn)VEGF165和VEGF189通過不同的機(jī)制參與了鼠兔腦和肌肉對缺氧的適應(yīng)，且VEGF189在鼠兔腦和肌肉中的表達(dá)高于VEGF165。此外，鼠兔大腦、肌肉和肺中的VEGE189水平還與其棲息地的海拔高度相關(guān)[24]。VEGF在高原鼠兔中有不同的表達(dá)模式，進(jìn)一步表明VEGF在高原鼠兔低氧適應(yīng)中的重要作用。

一氧化氮(NO)是一種有效的血管舒張劑，在預(yù)防缺氧性肺動脈高壓中起重要作用。NO由L-精氨酸的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)合成[25-26]，可通過增加胞漿內(nèi)環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平，進(jìn)而啟動細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白的磷酸化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對肺循環(huán)基礎(chǔ)張力和血流量的調(diào)節(jié)。高海拔地區(qū)的動物誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。在高原鼠兔體內(nèi)iNOS的表達(dá)和NO的產(chǎn)生均受到抑制，高原鼠兔體內(nèi)NO濃度的降低可能對高原鼠兔在低氧環(huán)境中的生存起著重要作用。

3.2 能量代謝

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是由HIF-1α和HIF-β組成的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。HIF-1是一種在大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在氧感應(yīng)和傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。HIF-1的α亞基是一個功能部位。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在正常氧氣條件下被泛素化和蛋白酶體降解，而在缺氧條件下降解途徑被阻斷，使HIF-1α積聚并遷移到細(xì)胞核。謝惠春等[27]研究表明，在缺氧環(huán)境中，HIF-1α通過調(diào)節(jié)骨骼肌中VEGF的表達(dá)來調(diào)節(jié)血管功能和提高血流量。也有研究表明在缺氧環(huán)境下，細(xì)胞中HIF-1可誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管生成[28]。新生的血管增加缺氧部分的血液供應(yīng)，以緩解組織細(xì)胞的缺氧情況[29]。研究表明，HIF-1α在高原鼠兔腦和腎中的表達(dá)較高，進(jìn)一步表明HIF-1對高原鼠兔在缺氧條件下生存適應(yīng)的重要作用[30]。

精子特異性乳酸脫氫酶-C4(sperm-specific lactate dehydrogenase，LDH-C4)基因，最早被發(fā)現(xiàn)在睪丸和精子中表達(dá)。LDH-C4是乳酸脫氫酶(LDH)同工酶之一。LDH-C4對丙酮酸的親和力高于乳酸，并催化人類和其他物種精液中丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，促進(jìn)糖酵解繼續(xù)產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine-5′-triphosadenine，ATP)。利用精子特異性乳酸脫氫酶的特異性抑制劑(N-isopropyl oxamate)證明，LDH-C4具有增強(qiáng)鼠兔的短跑能力，對高原鼠兔適應(yīng)高原缺氧環(huán)境具有重要作用[22]。研究表明，LDH-C在高原鼠兔骨骼肌中有利于丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，加速厭氧糖酵解生成ATP[26，31]。LDH-C在高原鼠兔骨骼肌中的表達(dá)增加了高原鼠兔的無氧糖酵解，減少對氧的消耗，增強(qiáng)了對高原缺氧環(huán)境的適應(yīng)能力[28]。

細(xì)胞色素c氧化酶(cytochromecoxidase，COX)是線粒體氧化能力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[32]。早期研究發(fā)現(xiàn)，呼吸鏈在真核生物的冷信號和缺氧信號中都有作用[33]。當(dāng)哺乳動物細(xì)胞暴露在氧氣濃度降低的環(huán)境中時，會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1，SOD 1)的表達(dá)增加。線粒體產(chǎn)生的ROS可以穩(wěn)定HIF-1α[34]。細(xì)胞色素c氧化酶通過蛋白質(zhì)硝基化途徑誘導(dǎo)核缺氧基因的表達(dá)[35]。通過比較高原鼠兔和北美鼠兔(Ochotonaprinceps)發(fā)現(xiàn)，高原鼠兔在Cox1和Cox2中氨基酸序列發(fā)生變化，在Cox1跨膜區(qū)域Ⅻ的452號位點(diǎn)，高原鼠兔存在蘇氨酸殘基，而北美鼠兔為蛋氨酸殘基。在Cox2的N端的5號位點(diǎn)，高原鼠兔的絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，這些氨基酸的替代可能是對低氧環(huán)境適應(yīng)的重要因素。同時，這些變化可以解釋線粒體基因組介導(dǎo)的細(xì)胞色素c氧化酶亞基修飾，這種修飾可增強(qiáng)缺氧時的線粒體呼吸，并有助于HIF-1調(diào)節(jié)復(fù)雜的Ⅳ亞基交換[36]。

3.3 攜氧蛋白

血紅蛋白具有儲存運(yùn)輸氧氣的功能，是組成遞氧系統(tǒng)的主要蛋白[37]。低氧是高原地區(qū)的主要特點(diǎn)，當(dāng)生物處于低氧環(huán)境時，體內(nèi)紅細(xì)胞中血紅蛋白增加，同時血紅蛋白與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白，增加與氧的親和力[38]。研究表明，高原鼠兔在不降低血氧飽和度的情況下，通過消除缺氧血管收縮驅(qū)動力，適應(yīng)低壓缺氧。高原鼠兔與人類血紅蛋白A的氨基酸序列比對，在高原鼠兔β氨基酸序列鏈中檢測到23種變異，α111和β115處最重要的氨基酸殘基(在人類血紅蛋白中形成α1β1接觸)發(fā)生了改變。這表明α1β1界面的氫鍵可能受到破壞，導(dǎo)致配體結(jié)合的構(gòu)象接觸改變，從而影響血紅蛋白與氧結(jié)合的能力[39]。

腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是主要在腦中表達(dá)的第3類攜氧珠蛋白，參與氧代謝、為細(xì)胞供氧供能，可以直接或間接促進(jìn)氧擴(kuò)散進(jìn)入線粒體，在微氧環(huán)境下，NGB可作為NADH氧化酶，在糖酵解過程中加速ATP生成，維持細(xì)胞正常功能[40]。NGB作為一種感受器，可以感知環(huán)境中氧氣的濃度變化，當(dāng)環(huán)境中氧氣濃度降低時，相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路會上調(diào)NGB的表達(dá)來避免缺氧損傷，從而使機(jī)體可以在不同的氧氣濃度下生存。組織對低氧的耐受性可通過內(nèi)源性保護(hù)因子NGB儲氧供氧來實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)鼠兔大腦皮層中NGB表達(dá)相對較高，在睪丸和腎上腺中也發(fā)現(xiàn)NGB具有較高的表達(dá)，由此可以推測NGB在其他組織也可以表達(dá)[41]。通過克隆高原鼠兔NGB基因，發(fā)現(xiàn)NGB mRNA定位于高原鼠兔的神經(jīng)元，神經(jīng)元突觸之間發(fā)現(xiàn)大量的NGB表達(dá)，毛細(xì)血管周圍也有較多的NGB表達(dá)，表明在高原缺氧條件下NGB基因可能通過介導(dǎo)神經(jīng)信號的傳導(dǎo)來適應(yīng)缺氧環(huán)境。

4 結(jié)語與展望

高原低氧適應(yīng)是高原醫(yī)學(xué)研究的核心內(nèi)容，高原鼠兔長年生活在高海拔、高寒地區(qū)，形成了一系列復(fù)雜的代償機(jī)制，具有很強(qiáng)的低氧適應(yīng)能力。研究人員對高原鼠兔的肺組織、心臟組織和血液中的血紅蛋白有了一定程度的認(rèn)識，并取得了一系列成果，但對高原鼠兔低氧適應(yīng)的研究仍處于發(fā)展階段。高原鼠兔全基因組測序工作至關(guān)重要，這對研究高原鼠兔低氧適應(yīng)相關(guān)基因具有重要意義。今后，希望可以獲得高原鼠兔的全基因組數(shù)據(jù)或通過三代測序得到較為準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過對高原鼠兔低氧適應(yīng)功能基因和信號通路的研究，尋找誘發(fā)高原病的靶基因，為高原病的預(yù)防和治療提供依據(jù)。