石首麋鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌病的綜合診斷

付宇航 汪明權(quán) 高 興 李可偉 楊 濤 張玉銘 李家奎*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院，武漢，430070；2.武漢動物園，武漢，430051；3.石首麋鹿國家級自然保護區(qū)，石首，434400)

麋鹿(Elaphurusdavidianus)是我國特有的珍稀瀕危鹿科(Cervidae)動物，也是國家一級重點保護野生動物[1]，被世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)列為野外滅絕(EW)[2]。2021年1月18—24日，湖北省石首麋鹿國家級自然保護區(qū)多頭麋鹿死亡，采集病死鹿組織和糞便樣品后送檢至華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院，通過麋鹿發(fā)病時的臨床癥狀、病理剖檢；細菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢，病理組織切片觀察；細菌16S rDNA PCR擴增及測序比對、多重PCR鑒定及生化鑒定，確診病死麋鹿為產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)感染。

1 臨床癥狀

發(fā)病麋鹿精神沉郁，步態(tài)緩慢，離群索居，食欲減退，喜飲水，肛門周圍污穢不堪，排醬油色稀便，內(nèi)混有脫落腸黏膜碎片(圖1)，繼而死亡。該病病程短，病死率高，鹿死后腹部迅速膨大，眼結(jié)膜充血，鼻孔流出帶血泡沫樣鼻液，發(fā)病鹿或死亡鹿大多為膘情好、體格健壯的成年鹿，雌鹿多于雄鹿。

圖1 發(fā)病麋鹿醬油色稀便

2 病理剖檢

剖檢發(fā)現(xiàn)：肝臟腫大邊緣鈍圓，呈淡粉色，質(zhì)脆，表面有出血斑或出血點(圖2A、B)。脾臟腫大，表面遍布出血斑，邊緣有壞死區(qū)(圖2C)。腎臟腫大呈土黃色，質(zhì)地柔軟易碎(圖2D)。心臟內(nèi)血液凝固不良，呈暗褐色(圖2E)。腸道黏膜可見出血性潰瘍或彌漫性出血性壞死，尤以空腸、回腸、盲腸最為嚴重，腸道膨大，呈灰綠色，內(nèi)充滿惡臭氣體(圖2F)。肺臟充血腫脹，肺泡腔內(nèi)充滿帶血泡沫樣液體。

圖2 發(fā)病麋鹿剖檢病理結(jié)果

3 實驗室診斷

3.1 病理組織切片觀察

空腸絨毛多壞死脫落，固有層、肌層有充血、漿液或纖維素滲出，固有層內(nèi)有大量炎性細胞浸潤(圖3A)。肝細胞均表現(xiàn)不同程度的顆粒變性、空泡變性和脂肪變性，中央靜脈內(nèi)充滿紅細胞，肝竇內(nèi)有紅細胞和少量炎性細胞浸潤(圖3B)。腎小球毛細血管擴張充血，腎小球腫脹，內(nèi)有大量炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞變性壞死，管腔狹窄，部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)脂肪變性和空泡變性，腎小管管腔中可見大量粉紅色漿液，腎間質(zhì)嚴重出血并混有少量炎性細胞(圖3C)。脾臟白髓和紅髓均可見淋巴細胞壞死，淋巴細胞數(shù)量減少，紅髓區(qū)結(jié)構(gòu)疏松，結(jié)構(gòu)不清晰，紅細胞顯著增多(圖3D)。

圖3 發(fā)病麋鹿組織病理切片

3.2 病料涂片染色鏡檢

無菌操作取腸道內(nèi)容物涂片經(jīng)革蘭氏染色后，置于100×油鏡下觀察，可觀察到鏡下菌體呈革蘭氏陽性，短桿狀，兩端鈍圓，單個或成雙排列(圖4)。

圖4 麋鹿腸道組織涂片革蘭氏染色鏡檢

3.3 細菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢

采用無菌操作方式，蘸取麋鹿肝、脾、腎、腸道內(nèi)容物，3區(qū)劃線接種于強化梭菌瓊脂培養(yǎng)基，將接種后的平板置于43 ℃厭氧培養(yǎng)18～24 h，次日挑取單菌落傳代純化培養(yǎng)，觀察純化培養(yǎng)后的菌落形態(tài)并挑取單菌落進行革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果顯示，菌落呈圓形，扁平，中央隆起，半透明，乳白色至淡黃色，邊緣整齊，直徑0.2～0.5 mm(圖5A)；菌體呈革蘭氏陽性、有莢膜的長桿狀菌，菌體兩端鈍圓，單個散在或成對存在(圖5B)。

圖5 麋鹿內(nèi)臟內(nèi)容物細菌培養(yǎng)與染色鏡檢結(jié)果

3.4 細菌生化鑒定試驗

將分離純化的細菌在超凈工作臺中接種于葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、肌醇、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、水楊苷、硫化氫、山梨醇、明膠生化發(fā)酵管和含鐵牛乳培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6～72 h。結(jié)果顯示，該菌可以發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖和肌醇，不發(fā)酵鼠李糖、甘露醇和山梨醇；硫化氫、明膠液化實驗結(jié)果呈陽性，七葉苷、水楊苷實驗結(jié)果呈陰性(表1)；在含鐵牛乳培養(yǎng)基發(fā)酵實驗中，該菌接種6 h后，發(fā)酵管中開始出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象，后牛奶凝固，并產(chǎn)生大量氣體使凝固的牛奶呈蜂窩狀，并置于培養(yǎng)基上層，呈“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象(圖6)。

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

圖6 含鐵牛乳培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果

3.5 細菌16S rDNA鑒定和多重PCR鑒定

按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明，提取分離純化菌株DNA作為PCR模板。細菌16S rDNA PCR反應(yīng)體系為25 μL，2×TaqMaster Mix 13 μL，上下游通用引物各1 μL，ddH2O 8 μL，DNA模板2 μL；多重PCR反應(yīng)體系為50 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，α、β、ε、ι毒素引物各1 μL，ddH2O 15 μL，DNA模板2 μL；PCR產(chǎn)物取7 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，剩余產(chǎn)物送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序，將序列結(jié)果上傳至https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行序列比對。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，分離純化株的16S rDNA的擴增條帶都在1 500 bp左右(圖7A)，序列比對表明分離株16S rDNA序列與產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組序列相似度達98.06%；多重PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只在325 bp左右出現(xiàn)條帶(圖7B)，未見其他長度條帶，序列比對結(jié)果與MH900562.1同源性達99.65%。

圖7 細菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳

4 藥敏結(jié)果

無菌操作吸取純化培養(yǎng)后的菌液100 μL，接種于強化梭菌瓊脂培養(yǎng)基上，并用棉簽涂布均勻，用鑷子夾取10種抗生素的藥敏片貼于培養(yǎng)基表面，置于43 ℃條件下厭氧培養(yǎng)18～24 h后，測量其抑菌圈直徑，判斷該菌株的耐藥性特點。結(jié)果顯示，該菌株對青霉素、氨芐西林、四環(huán)素、多西環(huán)素、氯霉素、紅霉素敏感，對新霉素、慶大霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明敏感性較差。

5 診斷結(jié)果與防治

根據(jù)臨床癥狀，組織涂片鏡檢、病理組織切片觀察、細菌分離培養(yǎng)和染色鏡檢、生化鑒定、細菌16S rDNA鑒定和多重PCR鑒定，最終確定本次麋鹿死亡是由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起。

因麋鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌病發(fā)病急，病程短，且野生麋鹿警覺性較高，較難捕獲，所以本案例并未針對麋鹿個體進行治療，而是采用劃區(qū)分隔飼養(yǎng)，加強飲水消毒，添加藥物于補飼飼料中的方法預(yù)防健康種群的發(fā)病，最終遏制了該病的進一步蔓延。

6 建議

麋鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌病通常由A型或E型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起[3]，該病的發(fā)病率較高、病程短，從發(fā)病到死亡只需幾個小時，病死率受溫差影響較大[4]，且由于野生動物本身特性，疫病防治主要原則為“預(yù)防為主，防重于治”[5]。要做好該病的預(yù)防工作，首先應(yīng)當加強飼養(yǎng)管理，對發(fā)病鹿應(yīng)及時采取隔離措施，防止急病進一步蔓延。針對發(fā)病個體，可根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選用青霉素、氯霉素等藥物進行治療，選用大劑量青霉素類和磺胺類藥物有一定療效，臨床上投服磺胺甲基異唑片能收到良好效果[6]。對于未發(fā)病動物，可使用人工制成的飼料進行補飼，在飼料生產(chǎn)的過程中，添加一些藥物或益生菌制劑可預(yù)防本病的發(fā)生，而且補飼的飼料中營養(yǎng)更全面，能夠增強麋鹿對疾病的抵抗能力。在該病高發(fā)的冬春季節(jié)，更換飼料種類時應(yīng)采取逐步過渡的方法，使得麋鹿瘤胃和腸道微生物菌群變化與食物變化相適應(yīng)[7]。定期對麋鹿群經(jīng)常活動區(qū)域和區(qū)域內(nèi)積水進行消毒，對病死麋鹿及其排泄物、分泌物作無公害處理，焚燒后表面覆蓋生石灰深埋處理等。