禽偏肺病毒對種鴨影響及治療體會

任年旭，張中波，劉潔，張東渺，馬元元，林正美，姜媛，杜永振，汪建華，李玉峰

（1.山東和康源生物育種股份有限公司，山東濟(jì)南 250101；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟(jì)南 250100）

1 前言

禽偏肺病毒在分類學(xué)上屬副黏病毒科（Paramyxoviridae）、 肺病毒亞科（Pneumovirinae）的偏肺病毒屬（Metapneumovirus）[1]。 主要感染火雞和雞。 偏肺病毒感染在臨床上主要以呼吸道癥狀為主，并出現(xiàn)咳嗽、流鼻液、腫頭以及產(chǎn)蛋下降等癥狀。 Sun 等在2014 年報道了我國南方的種番鴨暴發(fā)C 亞型禽偏肺病毒感染引起嚴(yán)重的產(chǎn)蛋下降，之后陸續(xù)有從水禽中檢出禽偏肺病毒的報道[1]。 有報道稱，法國番鴨發(fā)生了與C 亞型類似的病毒病， 但該病毒與C 亞型病毒的遺傳譜系不同，發(fā)病鴨表現(xiàn)為呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋下降[2]。 禽偏肺病毒感染一般在春季（3～4 月）和冬季（10～12 月）多發(fā)，種鴨在20～30 周的開產(chǎn)前期和開產(chǎn)爬坡期易感染，并混感大腸桿菌。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 檢測動物及病料

山東省泰安市、濟(jì)南市，河北省滄州市某父母代種鴨場的病鴨。

2.1.2 樣品采集

使用無菌棉簽擦取有咳嗽癥狀種鴨的喉頭表面或鼻腔分泌物、排泄物拭子，放入裝有無菌生理鹽水離心管中。 并摘取病死鴨的肺、 氣管、肝臟、脾臟、盲腸扁桃體裝入自封袋。

2.2 方法

2.2.1 樣品處理

病料處理 取處理好的病料， 剪碎放入滅菌的研磨器中，按1∶3～1∶5 的比例加入滅菌PBS（加雙抗，終濃度3000～5000 單位/毫升），研磨好后反復(fù)凍融3 次，8000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，取上清液備用，并將樣品編號。

拭子處理，置于含滅菌PBS（加雙抗，終濃度3000～5000 單位/毫升）的EP 管中，制成懸液，反復(fù)劇烈震蕩，8000 轉(zhuǎn)分鐘離心10 分鐘， 取上清備用。

2.2.2 病毒分離

將制備的上清液， 經(jīng)0.45 微米濾膜過濾除菌， 卵黃囊接種6～8 日齡SPF 雞胚或非免疫健康雞胚，0.2 毫升/胚，37℃孵育， 棄去24 小時內(nèi)死胚，繼續(xù)觀察8～10 天。 若不致死雞胚，則取48～96 小時尿囊液盲傳2～3 代， 觀察雞胚病變，收獲病變嚴(yán)重的尿囊液。

2.2.3 病毒的鑒定

禽偏肺病毒是單鏈RNA， 鑒定用RT-PCR的方法。

禽偏肺病毒引物序列 （退火溫度53℃，580bp）：

P1：GCAGCTGAAGTAGGAATGCAGTA

P2：CCTGCACCATAAGCTTGCA

2.2.4 結(jié)果判定

禽偏肺病毒RT-PCR 擴(kuò)增可以得到580bp大小的片段，擴(kuò)增到目的片段則判定相應(yīng)的病料為陽性。

2.2.5 細(xì)菌的分離與鑒定

取出密封袋中肝臟，點(diǎn)燃酒精燈，灼燒吊菌環(huán)，迅速插到肝臟內(nèi)，無菌采取采集肝臟組織于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、Baird-Parker 瓊脂培養(yǎng)基分別劃線5 個區(qū)域， 劃線分離，37℃培養(yǎng)24 小時，觀察菌落生長情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床癥狀及大體剖檢觀察

禽偏肺病毒感染臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕。 大體解剖可見氣管環(huán)出血，心肌出血（圖1A），喉頭氣管有黏液（圖1B），鼻竇有黏液，腹膜炎（圖1C），輸卵管堵塞（圖1D）。

圖1 病鴨大體剖檢病變

3.2 細(xì)菌分離與鑒定

將肝臟組織接種在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、Baird-Parker 瓊脂培養(yǎng)基上，并在37℃溫箱培養(yǎng)24 小時， 可觀察到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基5 個區(qū)域分別都有大量紅色菌落，Baird-Parker 瓊脂培養(yǎng)基未觀察到任何菌落生長。說明病鴨感染大腸桿菌，未感染葡萄球菌。

3.3 病毒PCR 檢測結(jié)果

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，被檢5 個樣品中，有1 只為偏肺病毒陽性，結(jié)果見圖2。

圖2 病鴨PCR 檢測結(jié)果

3.4 偏肺病毒對種鴨產(chǎn)蛋率影響及分析

養(yǎng)殖場1、2、4 種鴨分別在25、26、28 周產(chǎn)蛋爬坡期感染病毒，出現(xiàn)呼吸道癥狀，并出現(xiàn)產(chǎn)蛋率下降，降蛋幅度在10%～20%(見圖3)。 由于發(fā)病周期較長， 且混感大腸桿菌導(dǎo)致產(chǎn)蛋率無高峰，未達(dá)到90%。 養(yǎng)殖場3 在20 周產(chǎn)蛋前發(fā)病，發(fā)病周期較短，控制較早，產(chǎn)蛋率可以達(dá)到高峰。

圖3 感染偏肺病毒對種鴨產(chǎn)蛋率變化圖

4 結(jié)論與分析

根據(jù)解剖癥狀，PCR 檢測和細(xì)菌分離鑒定，確診為禽偏肺病毒感染并混感大腸桿菌，導(dǎo)致種鴨出現(xiàn)呼吸道癥狀，并影響種鴨產(chǎn)蛋率。 根據(jù)發(fā)病情況調(diào)查，禽偏肺病毒感染主要在春季（3～4月）和冬季（10～12 月）以及20～30 周處于開產(chǎn)前期和開產(chǎn)爬坡期的種鴨多發(fā)， 并混感大腸桿菌。導(dǎo)致種鴨出現(xiàn)輸卵管炎、腹膜炎等臨床癥狀，破壞種鴨生殖系統(tǒng)， 使鴨群產(chǎn)蛋高峰期產(chǎn)蛋率低于90%，造成產(chǎn)蛋無高峰。

5 治療與防控

通過進(jìn)行剖檢觀察、 細(xì)菌分離鑒定和PCR病毒檢測，該養(yǎng)殖場種鴨出現(xiàn)呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋率下降的主要原因是禽偏肺病毒和大腸桿菌混感。 根據(jù)診斷結(jié)果，使用抗病毒藥加抗生素的原則進(jìn)行治療[3]。 使用抗生素可以減輕細(xì)菌繼發(fā)感染進(jìn)而降低疾病的嚴(yán)重性[4]。 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選用多西環(huán)素治療，連用5 天，并配合使用治療呼吸道的中藥。 用藥治療后產(chǎn)蛋率上升、呼吸道癥狀減少、死淘率恢復(fù)正常。

雖然尚未見有關(guān)鴨偏肺病毒感染免疫預(yù)防的報道， 但火雞和雞的疫苗免疫和免疫研究值得借鑒[1]。 在飼養(yǎng)環(huán)境方面，改善鴨舍環(huán)境通風(fēng)，使用刺激較小的消毒藥帶鴨消毒， 每天消毒2次，減少病原并預(yù)防鴨群間的互相傳染。

6 討論

禽偏肺病毒感染主要引起產(chǎn)蛋鴨呼吸道癥狀、 產(chǎn)蛋率下降， 混感大腸桿菌會造成輸卵管炎、腹膜炎等癥狀，導(dǎo)致鴨群產(chǎn)蛋率無高峰。 根據(jù)禽偏肺病毒的基因序列特征可將其劃分為A、B、C、D 4 個亞型[4]。 通過基因測序公司檢測4次偏肺病毒陽性，均為C 亞型。 法國1999 年番鴨源C 亞型禽肺病毒分離株Fr-AMPV-C 的基因組全長為14152bp。我國番鴨源C 亞型偏肺病毒S-01 的基因組全長約14079bp, 與國外報道的C 亞型禽偏肺病毒全基因組序列同源性為92.3%～94.3%[1]。

禽偏肺病毒可通過病禽、水源、流動人員和設(shè)備等媒介發(fā)生水平傳播， 也有空氣和垂直傳播的可能，飼養(yǎng)密度過高、通風(fēng)不良、溫控不合理、衛(wèi)生條件差等都可誘發(fā)[5]。 目前，關(guān)于禽偏肺病毒對種鴨的影響研究較少， 預(yù)防措施主要包括易感季節(jié)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理， 必要時使用營養(yǎng)藥增強(qiáng)鴨群抵抗力， 及時使用抗生素減少混感細(xì)菌病，降低細(xì)菌對種鴨生殖系統(tǒng)的危害。