養殖水溫對吉富羅非魚幼魚血清和肝臟1H-NMR代謝組的影響

曾楠楠，蔣 明，文 華，田 娟，陸 星，吳 凡，喻麗娟

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心,上海 200120；2.中國水產科學研究院長江水產研究所,武漢 430223)

羅非魚是一種著名的熱帶養殖魚類，是水產養殖中產量位居世界第二的淡水魚。羅非魚的生活適宜溫度為26～29 ℃。當前溫度對羅非魚影響的研究大多集中在對其生長的影響上。關于溫度對羅非魚代謝機制的影響還未完全探明，需要進一步研究。

作為后基因組時代的產物，代謝組學是對生物樣品多組分混合物的定量分析，重點是建立生命系統的病理生理刺激或遺傳改變的代謝反應，來自體液或組織的大量小分子代謝物可被一步定量檢測。近年來，代謝組學平臺也應用于魚類研究范疇，如ASAKURA等基于核磁共振的代謝組學方法評估了飼料類型對魚類-微生物共生生態系統中共代謝調節的影響；WEI等通過運用NMR代謝組技術探討了魚粉的替代物對大鯪鲆(L.)的作用機制；蔣明等在對團頭魴的探討中，運用H-NMR的代謝組學技術揭示了微量元素鋅對其代謝的影響。在這些研究中，基于核磁共振的代謝組學方法被用于揭示營養與魚類代謝狀態的關系。與此同時，代謝組學也開始被用于探究溫度對魚類代謝機制的影響，如KULLGREN等利用基于H-NMR的代謝組學分析大西洋鮭魚()血漿的結果顯示，高溫誘導了谷氨酰胺，酪氨酸和苯丙氨酸的下降和脂質代謝的轉變。本研究應用H-NMR組學方法檢測分析了在三種溫度條件下飼養8周后吉富羅非魚(，)的血清和肝臟代謝物，探究水溫對羅非魚生理代謝影響的作用機制,以期為羅非魚養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料與養殖管理

實驗魚購自廣西羅非魚國家級育種試驗場，暫養2周后將大小均勻活潑健康的吉富羅非魚隨機分配至9個養殖桶中，每桶20尾。采用電加熱系統和水空調控溫，在22、28、34 ℃三個養殖水溫下，以試驗飼料投喂初始平均體質量為(38.75±0.61) g的吉富羅非魚8周。投喂的半純化飼料配方見表1，每日在8:30、12:30和16:30人工投喂3次，30 min內表觀飽食投喂并記錄每日投喂量。將22、28和34 ℃溫度組分別標記為低溫(LT)、適溫(MT)和高溫(HT)組。飼養期間pH 7.4～7.6，溶氧保持5.0 mg/L以上，自然光照周期，每日早上對循環水系統進行反沖洗，更換5%左右的新水，控制水溫波動在1 ℃之內，并清除養殖桶內糞便。

表1 實驗飼料配方及營養成分Tab.1 Formulation and proximate analysis of the experiment diet g/kg

1.2 實驗樣品制備和測定

8周的飼喂實驗結束后，將魚禁食24 h，記錄每個養殖桶內吉富羅非魚的尾數和終末體質量，統計實驗期間消耗的飼料質量。在每個養殖桶中隨機取3尾魚測量體重和體長，然后通過尾部靜脈抽取血樣存放于離心管，在常溫下靜置30 min后在離心機上離心(3 000 r/min，10 min)，將得到的血清凍存在-80 ℃冰箱中。常規解剖分離出三尾實驗魚的內臟和肝臟等稱其質量，并將部分肝臟標本凍存在液氮中。肝臟和血清的代謝產物均采用H-NMR代謝組方法定量和定性。

1.3 血清和肝臟1H-NMR代謝物檢測

將冷凍干燥的肝臟樣品粉末稱重50 mg并加入1 000 mL純水，渦旋1 min，使用4秒開/3秒關循環程序(8個循環)(Sonic VX-130，USA)在冷水浴中進行32秒超聲提取。將樣品離心(4 ℃，13 000 r/min)15 min后，將水膜轉移到0.5 mL 3 kDa超濾膜離心過濾器(Millipore，USA)中離心(4 ℃，13 000 r/min)45 min后收集濾液。取450 μL澄清透明濾液放于新編號的2 mL離心管，加入50 μL DSS試劑(Anachro，Canada)后渦旋10秒，然后在4 ℃、13 000 r/min條件下離心2 min。將480 μL上清液置于5 mm的核磁共振管中(Norell，USA)。使用AV600MHz光譜儀收集光譜(采集參數見表2)。利用2D-1H、1H-NOESY脈沖序列的第一個增量獲得H-NMR數據并抑制溶劑信號。實驗分析了混合時間100 ms以及990 ms的預飽和度。在25 ℃下收集光譜并在15 min內共掃描128次。血清樣品解凍后無需加純水，渦旋30秒后離心(4 ℃，13 000 r/min)2 min，取上清液700 μL于超濾膜離心過濾離心(4 ℃，13 000 r/min)65 min收集濾液，而后的采集步驟與肝臟樣品一致。

表2 核磁數據采集參數Tab.2 Acquisition parameters and data of 1H-NMR

1.4 數據處理與分析方法

本實驗使用Chenomx NMR suit軟件，把H-NMR自由感應衰減(FID)信號導入后開始傅里葉變換、相位調整和基線校正。DSS峰值(0.0 ppm)為所有光譜化學位秱標準，開始反卷積操作，調整色譜峰峰形(CSI)。按照H-NMR光譜信號的峰形、化學位秱、耦合裂分、半峰寬等有效信息，依據譜峰面積和DSS濃度，聯合Chenomx自帶數據庫對實驗樣本的光譜信號一一進行比較分析，得到樣本中差異的代謝產物和相應的絕對密度。將得到的代謝物和它們的絕對濃度含量傳到EXCEL表格中，就會出現一個變量矩陣。這個變量矩陣即是后面進行PCA和PLS-DA分析的數據來源。主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA)是運用R語言分別通過PCA方法Bioconductor package和PLS package進行分析，并通過ggplot2 package來實現可視化。

數據均以平均值±標準差表示，在SPSS 19.0統計軟件中運用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey′s檢驗確定結果的差異顯著性，當<0.05時，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 溫度對實驗魚生長性能的影響

不同溫度條件下飼養8周后吉富羅非魚的生長性能和飼料利用率見表3。可以看出，養殖水溫顯著影響實驗魚的終末體質量、增重率和飼料系數。其中28 ℃條件下的實驗魚的生長表現最好，顯著優于22 ℃，與34 ℃的實驗魚無顯著差異；飼料系數在22 ℃條件下出現最大值且顯著高于其他兩組，而另外兩組之間無明顯差異。養殖水溫對實驗魚的肝體指數(HIS)也有顯著影響，MT組的肝體比明顯高于其余兩組，而LT和HT組之間無顯著差異；三組實驗魚的臟體比(VSI)之間均無顯著差異。

表3 吉富羅非魚不同溫度下生長表現Tab.3 Growth performance of O.niloticus at different temperatures

2.2 樣本代謝物譜圖及代謝物種類

將實驗中肝臟和血清樣本的譜圖信號按照Chenomx 軟件數據庫進行比較分析，獲得的代謝物分別45種(見圖1)和47種(見圖2)。除僅肝臟中含有4-氨基丁酸酯、煙酸、泛酸、牛磺酸、尿素等16種代謝物和血清中含有的精氨酸、二甲胺、乙醇、甲酸酯、甘氨酸、異丁酸酯、T-甲基組氨酸、丙酮酸、肌氨酸、三甲胺N-氧化物、肌醇和反式-4-羥基-L-脯氨酸等17種代謝物外，實驗中大部分定量和定性的代謝物在肝臟和血清之間是相同的，共有代謝物包括14種氨基酸及其衍生物，2種胺和胺化合物，5種有機酸，6種核酸組分，2種糖類(葡萄糖、甘露糖等)和1種其他組分(泛酸等)。醇類(乙醇、肌醇)代謝物僅在血清中檢測出。

圖1 吉富羅非魚肝臟樣本信號歸屬片段Fig.1 Signal assignment spectrum of liver from O.niloticus

圖2 吉富羅非魚血清樣本信號歸屬片段Fig.2 Signal assignment spectrum of serum from O.niloticus

2.3 血清PLS-DA和VIP分析

2.3.1 PLS-DA和PLS載荷分析

圖3A1為實驗魚血清樣本的PLS-DA結果圖，如圖所示，同組實驗樣本聚集在一起，這表明同組內樣本的重復性可靠，變異較小；三組樣本在主成分2方向上有分開的趨勢，可推測主成分2方向上三個實驗組中血清樣本的代謝輪廓有差異；而在主成分1方向上所有實驗組未分離，表明實驗魚在主成分1方向上代謝輪廓相似。圖3A2為血清樣本PLS載荷圖，可以看出：葡萄糖、乳酸、丙氨酸等代謝物在區分不同樣本間中發揮了重要作用。

圖3 來自LT、MT和HT組之間的吉富羅非魚血清樣本1H-NMR光譜得到的PLS-DA得分圖(A1)和PLS-DA載荷圖(A2)Fig.3 PLS-DA score plot (A1) and loading plot (A2) derived from 1H-NMR spectra of serum of O.niloticus

2.3.2 VIP差異代謝物分析

圖4B1為三組實驗魚血清樣本VIP得分圖，如圖所示，血清中第一重要差異代謝物為乳酸，剩余14種差異代謝物依次為脯氨酸、葡萄糖、檸檬酸、反式-4-羥基、乙醇、肌酸、亮氨酸、甜菜堿、纈氨酸、谷氨酰胺、三甲胺、甘露糖、酪氨酸和肌酐。對PLS-DA分析得到的VIP值大于1的代謝物進行ANOVA分析發現，血清中脯氨酸的濃度在三組間差異顯著(圖3-4B2)。HT組的血清檸檬酸、乙醇、甜菜堿、谷氨酰胺、三甲胺和肌酐顯著高于其他兩組；LT組的血清中除乳酸、脯氨酸、葡萄糖、反式-4-羥基、肌酸、亮氨酸和纈氨酸高于其他兩組外，其余代謝物濃度均顯著低于其他兩組；而MT組血清中的甘露糖和酪氨酸濃度顯著高于其他兩組(見表4)。

圖4 來自LT、MT和HT組之間的吉富羅非魚血清樣本1H-NMR光譜得到的VIP得分圖(B1)和PLS-DA分析得到的VIP值大于1的代謝物的ANOVA分析圖(B2)Fig .4 VIP score plot (B1) and ANOVA analysis chart (B2) of metabolites with VIP value greater than 1 obtained by PLS-DA analysis derived from 1H-NMR spectra of blunt snout bream of O.niloticus

表4 血清差異代謝物列表及濃度Tab.4 List and concentration of serum differential metabolites mmol/L

2.4 肝臟PLS-DA和VIP分析

2.4.1 PLS-DA和PLS載荷分析

圖5C1為肝臟樣本PLS-DA得分圖，結果顯示，同組實驗樣本聚集在一起，表明平行樣本間重復度高，變異較小；而LT組和另外兩組的實驗樣本在主成分1方向上顯示分離，表明在此方向上LT組實驗魚的代謝輪廓與其他兩組較為不同；在主成分2方向上，實驗樣本基本相近，表明在該方向上三組實驗魚的代謝輪廓較為相似。圖5C2為三個實驗組肝臟樣本PLS載荷圖，可以看出：葡萄糖、麥芽糖等代謝物在樣本間的區分中做出了重要貢獻。

圖5 來自LT、MT和HT組之間的吉富羅非魚肝臟樣本1H-NMR光譜得到的PLS-DA得分圖(C1)和PLS-DA載荷圖(C2)Fig.5 PLS-DA score plot (C1) and loading plot (C2) derived from 1H-NMR spectra of liver tissue of O.niloticus

2.4.2 VIP差異代謝物分析

圖6D1為三組實驗魚肝臟樣本VIP圖，如圖所示，肝臟中第一重要的差異代謝物為麥芽糖，剩余14種主要差異代謝物均為氨基酸及氨基酸衍生物。對三組代謝物進行ANOVA分析發現，PLS-DA分析得到的VIP值大于1的代謝物除麥芽糖外，其余代謝物濃度各組間差異均顯著(圖6D2)。LT組的肝臟中15種差異代謝物濃度均高于其他兩組；MT組的肝臟中除麥芽糖、谷氨酸鹽、賴氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸和蘇氨酸濃度高于HT組外，其余差異代謝物濃度均低于HT組(見表5)。

圖6 來自LT、MT和HT組之間的吉富羅非魚肝臟樣本1 H NMR光譜得到的VIP得分圖(D1)和PLS-DA分析得到的VIP值大于1的代謝物的ANOVA分析圖(D2)Fig.6 VIP score plot (D1) and ANOVA analysis chart (D2) of metabolites with VIP value greater than 1 obtained by PLS-DA analysis derived from 1H-NMR spectra of liver tissue of O.niloticus

3.1 水溫對吉富羅非魚肝臟代謝組的影響

在肝臟組織中，LT、MT和HT組的15種主要差異代謝物中，有13種是氨基酸或者氨基酸代謝中間物，這充分說明溫度對吉富羅非魚氨基酸代謝具有顯著的影響。類似地，ZHAO等指出高溫應激吉富羅非魚，主要影響的是其氨基酸代謝通路。與MT組相比較，HT組和LT組實驗魚中的亮氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等8種氨基酸的濃度明顯升高，其中亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸為支鏈氨基酸(BCAA)，BCAA可通過擴大TCA(三羧酸循環)中間體(anaplerosis)和進入糖異生等途徑來促進能量代謝，其余5種氨基酸也均可通過生糖促進TCA循環。這意味著高溫和低溫條件下吉富羅非魚體內氨基酸會通過代謝生成葡萄糖產生能量，進而降低氨基酸利用率。而關于實驗魚肝臟中牛磺酸的含量，LT組中濃度最高、MT組次之，HT組中濃度最低，這表明溫度會顯著影響魚體肝臟中牛磺酸代謝。

由賓石玉等研究發現當水溫降至15 ℃，埃及尼羅羅非魚肝臟、脾臟開始出現溶解的現象；TASCI等研究發現喂食牛磺酸可以改善鼠的肝損傷和肝臟纖維化。由此可以推斷LT組牛磺酸濃度顯著升高可能是一種響應機制，因為長時間的低溫環境導致吉富羅非魚的肝臟受損。同時，LT組中麥芽糖、谷氨酰胺、谷氨酸濃度也最高，MT組次之，HT組最低。谷氨酰胺通過谷氨酸可作為TCA循環中間體α-酮戊二酸的前體。LT組中麥芽糖、谷氨酰胺和谷氨酸的升高進一步證實在低溫條件下吉富羅非魚糖代謝會增強且能量升高。且與前面低溫導致吉富羅非魚肝臟受損的假設一致，LT組谷氨酰胺含量顯著升高可提高機體的抗氧化能力，保護肝臟及免疫細胞以維持肝臟的正常功能。肝臟組織代謝物的結果表明溫度顯著影響吉富羅非魚的氨基酸代謝和糖代謝通路，低溫條件下吉富羅非魚生長受限可能是由于不適宜的飼養溫度會其降低對氨基酸的利用率；代謝組結果表明HT組條件下飼養的吉富羅非魚的體內生理代謝具有顯著變化，但HT組實驗魚的生長速度和飼料利用率雖與MT組無顯著差異，可能是由于實驗養殖時間較短還未反映到其表型上。

3.2 水溫對吉富羅非魚血清代謝組的影響

在血清中，LT、MT和HT組的第1差異物是乳酸。LT組實驗魚中乳酸濃度最高，HT組次之，MT組最低。血液中乳酸含量升高代表可能血液循環代謝有障礙。LT組中除乳酸外，葡萄糖、脯氨酸、反式-4-羥基、肌酸的含量也明顯上升。血清中葡萄糖含量升高，意味著糖酵解增加并會影響某些氨基酸的代謝(如蘇氨酸和酪氨酸)，這與肝臟中代謝組得到的結果(低溫條件下吉富羅非魚糖代謝會增強且能量升高)相統一。過量的葡萄糖可以通過新的脂肪生成(DNL)作為糖原或脂肪酸儲存在肝臟中，也可以作為磷酸肌酸儲存，用于再生ATP的能量儲備。具有細胞能量穿梭功能的肌酸是維持細胞能量穩態的關鍵組成部分。LT組魚中觀察到高肌酸水平可能是對低溫壓力的代謝反應，也可以解釋低溫條件下吉富羅非魚增長率較低的原因。脯氨酸屬于與抗感染相關的精氨酸和脯氨酸代謝，ZHAO等發現添加2 mg外源脯氨酸可使高溫條件下吉富羅非魚的死亡率由81%降至45%，而添加L-蘇氨酸和L-天冬氨酸則未能提高存活率，表明脯氨酸與增強抗感染能力進而促進適應非適宜溫度有密切關系，這與本實驗的研究結果是一致的。

HT組中甜菜堿、谷氨酰胺、三甲胺和肌酐顯著高于其他兩組，而MT組高于LT組。有研究發現，鼠中添加甜菜堿后血漿中低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯含量升高；且有研究表明甜菜堿可以促進脂肪分解及脂肪酸氧化。三甲胺(TMA)是膽堿的代謝產物，可以作為蛋白質在高溫下的穩定劑。由以上研究我們可以假設增加的TMA水平來源于膽堿代謝，是對高溫的適應性反應，則血清中甜菜堿和三甲胺含量升高說明高溫對脂質代謝、膽堿代謝也有一定的影響。

4 結論

綜上所述可見，低溫條件下，吉富羅非魚糖代謝增強，氨基酸的利用率降低，進而影響羅非魚的生長速度和飼料利用率；高溫條件下飼養的吉富羅非魚體內脯氨酸、三甲胺和甜菜堿等代謝物濃度升高，很可能是對高溫的適應性反應，飼料中添加甜菜堿、脯氨酸、三甲胺等可能會增強羅非魚在高溫條件下的抵抗力。