豬圓環病毒2型抗體與病原檢測相關性分析

袁翠平，賀會利，馬宇毅，岑 敏，李 軍

（廣西獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室 530001）

豬圓環病毒（Porcinecircovirus，PCV）屬于圓環病毒科圓環病毒屬的DNA病毒，呈閉合單股環狀，是負鏈無囊膜結構，為目前已知的最小哺乳動物病毒[1-2]。根據其抗原性及基因組，可以分為：豬圓環病毒1型（PCV-1）、豬圓環病毒2型（PCV-2）、豬圓環病毒3型（PCV-3），其中PCV-1幾乎不引起豬群疾病[3]。PCV-2對豬群有非常強的致病性，主要引起斷奶豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道疾病復合征（PRDC）、母豬繁殖障礙及豬間質性肺炎等癥狀[4-5]。PCV-3引起母豬皮炎腎病綜合征與繁殖障礙，仔豬腹瀉，現處于研究階段。2019年，豬群中發現了基因大小為1770bp的圓環病毒，定為豬圓環病毒4型(PCV-4)[6]，PCV-4在我國也廣泛存在，但由于PCV-4是2019年才發現的，研究資料較少。PCV-2目前是養殖場豬的主要元兇[7]，雖然疫苗在PCV-2的防控中發揮一定作用，但是國內豬群普遍存在PCV-2的感染情況[8]，PCV-2主要破壞機體的免疫功能，以淋巴腫大、淋巴細胞減少為特征，從而引起免疫抑制，增加了與其他病原體混合感染的機會，從而導致病豬的死亡率升高，極大地阻礙了養豬業的健康發展。本試驗通過對豬群PCV-2的抗體和病原檢測，對比結果分析抗體水平和野毒感染之間的關系，從而發現潛在的易感群體，評估疫病的防控效果，進而為PCV-2的診斷提供科學依據，減少經濟損失，提高養殖業收入。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器病毒DNA提取試劑盒、2×ESTaq-MasterMix、DNAMarker2000等由北京康為世紀生物科技有限公司提供；瓊脂糖凝膠購自西班牙GENE公司；LifePCR儀、凝膠成像系統購自Bio-rad公司。PCV-2ELISA抗體檢測試劑盒購自韓國JBT公司；臺式離心機購自德國Eppendorf公司；LabsystemsDragonMK3酶標儀購自芬蘭雷勃公司。

1.1.2 臨床樣品采集自廣西南寧規模化豬場的保育豬血清115份、育肥豬血清183份，共298份。陽性樣品由廣西獸醫生物技術重點實驗室保存。所有檢測豬均過免疫PCV-2滅活疫苗。

1.2 方法

1.2.1 PCV-2抗體水平無菌前腔靜脈采血，采集的全血8000r/min離心5～10min后，取上清液，PCV-2抗體檢測操作步驟和結果判斷按使用的說明書進行。

1.2.2 樣品RNA/DNA提取取1.2.1離心后的上清液，按照病毒DNA提取試劑盒中的說明書提取血清樣品中DNA，提取的病毒核酸樣品放于-20℃保存備用。

1.2.3 引物合成PCV-2的PCR檢測方法按連慧香等[9]方法進行。引物序列：PCV-2-F:CCGCGGGCTGGCTGAACTT，PCV-2-R:ACCCCCGCCACCGCTACC。引物交由廣州華大基因科技有限公司合成。

1.2.4 PCR擴增以PCV-2引物序列對298份血清進行PCR擴增。PCR的反應體系為：樣品DNA模板3μL，2×Es-TaqMasterMix13μL，上游引物、下游引物各1μL（引物濃度25pmol/μL），ddH2O7μL，總反應體系共25μL。PCR的反應程序為預變性溫度95℃，預變性時間5min；同一溫度下變性1min；退火溫度55℃，退火時間1min；延伸溫度72℃延伸時間1min30s；30～35個循環后，需72℃再延伸10min，目的片段大小為1154bp。使用1.5%～2.0%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物做電泳檢測，電泳時間25～30min，使用凝膠成像儀觀察試驗結果。

1.2.5 數據統計分析用Excel軟件對PCV-2的抗體和病原結果進行統計分析。

2 結果

2.1 PCV-2抗體檢測結果

通過對298份豬血清樣品檢測PCV-2抗體，抗體的陽性率為89.93%（268/298），PCV-2抗體的檢測結果達到群體免疫合格率（70%以上）。其中保育豬的陽性率為90.43（104/115），育肥豬的陽性率為89.61%（164/183）。

2.2 PCR擴增結果

對298份血清樣品和陽性樣品同時進行PCR檢測。結果顯示陽性樣品的片段為1154bp，血清樣品與陽性結果一致則說明PCV-2病原陽性，血清樣品無條帶則說明PCV-2陰性（圖1）。病原檢測298份血清樣品中，21份病原陽性，277份病原陰性。

圖1 部分樣品中PCV-2擴增電泳結果

2.3 結果統計分析

抗體檢測298份血清樣品中，268份PCV-2抗體陽性，30份PCV-2抗體陰性。病原檢測298份血清樣品中，21份病原陽性，277份病原陰性。30份PCV-2抗體陰性中圓環病毒陽性率為43.33%（13/30）；268份PCV-2抗體陽性中圓環病毒陽性率為2.99%（8/268）；268份抗體陽性的平均S/P值為1.417；21份病原陽性的血清抗體陽性的平均S/P值為0.503；8份病原陽性且抗體陽性的血清樣品平均S/P值為1.041；13份病原陽性且抗體陰性的血清樣品平均S/P值為0.222，說明當PCV-2抗體陰性時圓環病毒陽性率更高。豬血清中病原含量與抗體水平之間呈現不同的相關性。

3 討論

本試驗采用韓國JBT公司生產的試劑盒，檢測樣品為血清，298份豬血清PCV-2抗體的S/P都小于1.8，268份抗體陽性的平均S/P值為1.417，21份病原陽性的血清抗體陽性的平均S/P值為0.503，說明當PCV-2抗體陰性時圓環病毒陽性率更高。通過查閱相關資料，發現這與孫華偉等[10]人的研究有出入。分析原因：本豬場的豬疫苗免疫時間已久，未發現PCV-2抗體的S/P高于1.8；PCV-2進入體內后首先在扁桃體和淋巴結中復制，隨后通過初級淋巴組織進入全身淋巴組織器官，最后進入全身各組織器官，肺臟是PCV-2侵染的主要靶組織。本試驗的樣品為血清，血清中的成分易受環境影響，干擾因素比組織樣品多；豬群PCV-2感染比例隨著年齡增加而升高，因此豬群的年齡與此也有一定關系。因此檢測的穩定性需要更多數據支撐。本試驗只是初步探討血清中抗體與病原之間的關系，尚存在很多不足。試驗說明僅僅根據抗體檢測，還不能準確地判定豬群是否感染了野毒，還有待更深入的研究通過抗體檢測判斷豬群是否感染了野毒。

自2000年，郎洪武等[11]初次分離出PCV-2，目前，我國多地均有PCV-2感染情況的報道[12-16]。PCV-2不僅在豬群分離到，在人、牛、嚙齒動物等以及水、空氣、人用疫苗中都發現有PCV-2這為PCV-2的防控帶來嚴峻的考驗[17]。PCV-2對外界抵抗力極強，可與其他病毒發生混合感染，如：豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒等病原，從而誘發其他疾病發生，導致豬只死亡率明顯升高，最終給養豬業造成巨大的經濟損失。潘奕凡等[18]人研究發現增加免疫頻次可以提高豬的抗體水平，增強對PCV-2的抵抗力，達到降低PCV-2病原陽性率，目前獸醫臨床上除豬偽狂犬病病毒 gpI 抗體(野毒)檢測試劑盒外，其余抗體檢測試劑盒均不能區分檢測到的抗體來是疫苗免疫還是野毒感染。由本試驗可知，無論豬群的疫苗免疫接種是否合格，豬群都有可能感染圓環病毒2型。臨床上不僅需要檢測豬群的抗體水平，同時應該檢測其病原，將攜帶有病毒的豬群進行有效的淘汰和凈化，對抗體檢測為陰性的豬群進行強化免疫。本試驗通過檢測抗體與病原，揭示其之間的相關性，為該病的診斷提供參考。