苗藥葉上花莖和根的顯微鑒別

宋夢姿，蔣艷洲，路瑀璠，羅春麗※

（1.貴州大學(xué)貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗室，貴州 貴陽 550025；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖北 武漢 430030；3.黔西南州義龍藍(lán)天學(xué)校，貴州 興義 562400）

葉上花[Helwingia japonica(Thunb.)Dietr.]是山茱萸科青莢葉屬的落葉小灌木[1]，全株可作藥[2,3]，又被稱為葉上珠、葉上果等。和平時常見植物的開花結(jié)果不同，葉上花的花果都長在葉片上，一般在中間葉脈靠近葉柄的位置，開花部位特殊且花的美感性強(qiáng)，因此，在藥用價值和觀賞價值方面都引起了人們的廣泛關(guān)注，成為了一種難得的、可以進(jìn)行關(guān)注開發(fā)的藥用植物。

顯微鑒別方法作為中藥鑒別方法之一，被許多學(xué)者用來鑒別藥材的真?zhèn)巍?yōu)劣及純度等。如李俊松等[4]利用性狀和粉末顯微鑒別等將百部科百部屬中塊根外形極為相似的3個物種區(qū)分。高敏等[5]用粉末顯微鑒定方法對2005版《中國藥典》收錄的5個品種淫羊藿進(jìn)行分析，最終以葉片非腺毛和上表皮細(xì)胞特征作為鑒別依據(jù)。覃挺紅等[6]通過性狀、顯微鑒別方法比較易混淆的6種紫珠屬植物葉片，對其紫珠屬葉類藥材的利用提供重大意義。

葉上花作為苗族習(xí)用藥材，目前開展的相關(guān)研究極少；同時，由于西南少數(shù)民族地區(qū)特殊的地形和文化傳播方式，造成了葉上花在流傳過程中易混品種較多，不利于葉上花的研究、開發(fā)和利用[7-12]。因此，以苗族習(xí)用葉上花為研究對象進(jìn)行了植物形態(tài)、根、莖及粉末的顯微鑒別，以期為其進(jìn)一步系統(tǒng)生藥學(xué)鑒別及合理應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗條件

實(shí)驗地點(diǎn)：貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗室；貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥藥劑學(xué)實(shí)驗室。

實(shí)驗材料：材料來源于貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)清灣村野生的葉上花。

儀器設(shè)備：石蠟切片機(jī)（YD-201A型，浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；生物組織烤片機(jī)（YD-B型，浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡（OLYMPUS DP73型，日本Olympus公司）；體視顯微鏡（Nikon SMZ800型，日本尼康公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-3AB型，天津市泰斯特儀器有限公司）。

實(shí)驗試劑：無水乙醇（重慶川東化工有限公司）；二甲苯、冰乙酸和甘油（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；苯酚、堿性品紅和水合氯醛（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；甲醛（西隴科學(xué)股份有限公司）；丙酸（上海麥克林生化科技有限公司）；番紅花紅T（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；固綠（北京索萊寶科技有限公司）；明膠（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；龍膽紫（中國上海遠(yuǎn)航試劑廠）。實(shí)驗所用FAA固定液、FPA固定液、1%番紅染液、0.5%固綠染液、黏片劑、軟化劑均為按比例自行配制試劑。

1.2 實(shí)驗方法

根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)和藥用植物相關(guān)的書籍對青莢葉、中華青莢葉、浙江青莢葉、峨眉青莢葉和西域青莢葉的形態(tài)描述及分布，對比植株本身，確定其植株的來源。從整體植株形態(tài)對本次實(shí)驗材料進(jìn)行描述，并觀察各部分的大小、性狀、顏色及斷面的特征。

研究所用的葉上花的莖和根使用FAA或FPA固定液進(jìn)行固定，固定時間為24h，采用石蠟切片技術(shù)[13,14]對葉上花的莖和根進(jìn)行制片，切片的厚度為8m。用番紅 固綠染液（對染法）[15]對制好的葉上花莖的橫切片進(jìn)行染色；用堿性品紅 龍膽紫[16]染液（二重染色法）對葉上花的根進(jìn)行染色，根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)節(jié)脫水、浸蠟時間[17]，對于木質(zhì)化嚴(yán)重的部位可以進(jìn)行軟化[18,19]。裝片用熒光顯微鏡（OLYMPUS DP73型）和體視顯微鏡（Nikon SMZ800型）觀察，選擇符合要求、相對清晰的圖片進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 來源鑒定

根據(jù)已知藥用植物相關(guān)書籍與文獻(xiàn)[20,21]中對青莢葉、中華青莢葉、浙江青莢葉、峨眉青莢葉和西域青莢葉的形態(tài)描述及分布情況可知：青莢葉屬的植物喜愛蔭蔽環(huán)境，且耐濕潤，我國擁有的青莢葉屬植物有5種，且大多品種分布于四川、云南境內(nèi)，尤其是中華青莢葉和西域青莢葉。根據(jù)《中國植物志》中對5種青莢葉的敘述可知：中華青莢葉屬于落葉小灌木，葉片背面顏色比正面淺，為淺綠色；葉片為線狀披針形、狹披針形，葉不如其他4種青莢葉的葉寬；葉緣的短刺為腺狀具細(xì)鋸齒等不同特征，對比植株本身確定實(shí)驗材料為中華青莢葉。

圖1 葉上花性狀圖Fig.1 The characteristic of Helwingia japonica

觀察并記錄中華青莢葉的各部位外觀性狀如下：葉上花植株全株高可達(dá)1~3 m，屬落葉的小灌木。葉上花的根為直根系，主根為近圓柱狀，表面較粗糙，有栓皮和皮孔，質(zhì)重堅實(shí)，折斷面纖維性，形成層環(huán)紋內(nèi)的木質(zhì)部發(fā)達(dá)。莖為攀緣莖，呈圓柱形，直徑為0.3~1 cm，存在木質(zhì)化現(xiàn)象的主莖表面呈深棕紫色，顏色隨著莖的幼嫩程度而逐漸變深綠，表面無毛，具有縱紋和少量紋孔，木質(zhì)莖質(zhì)硬而韌，不易折斷，嫩莖斷面有黏質(zhì)液體。葉片為披針形，質(zhì)感為革質(zhì)或近革質(zhì)，兩面均光滑無毛，葉片背面顏色較正面淺，葉片互生，葉尖端略驟尖，葉基呈楔形，葉緣呈睫毛狀，具有短刺，葉脈為羽狀網(wǎng)脈，主葉脈靠近葉柄部分呈暗紫色，其余部分呈深綠色，越靠近植株頂端，葉生長越密集。花朵開在靠近葉柄部分的主葉脈上，花瓣一般為3片，為卵形的排列方式；雌雄異株，雄花的花梗極短，為傘狀花序，花藥3~5個；雌花無花梗[20]；花期4~5月，果落后會留下果梗殘基。

2.2 莖的橫切面顯微結(jié)構(gòu)

實(shí)驗材料所用的葉上花的莖屬于幼嫩部位，所用材料的直徑約為1 890m，切片（圖2）中看到的是莖的初生構(gòu)造，周皮不發(fā)達(dá)，可以看出莖的表皮、皮層、髓和維管束等部分[22]。

圖2 葉上花莖橫切面圖（左：100x；右：60x）Fig.2 Stem cross section diagrams of Helwingia japonica(Left:100x;Right:60x)

表皮細(xì)胞單列，由長方形扁平細(xì)胞緊緊相連并規(guī)則排列而成，切片中可能存在皺縮現(xiàn)象影響觀察效果，觀察到表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁略微加厚，即存在角質(zhì)化現(xiàn)象；皮層由多層球形、多面體等不規(guī)則形狀細(xì)胞組成，實(shí)驗中皮層寬度約為273m；越接近維管柱細(xì)胞越大，細(xì)胞壁越薄，多數(shù)為薄壁細(xì)胞，沒有表皮細(xì)胞排列的緊密度高，內(nèi)含棕色物質(zhì)，可以觀察到草酸鈣方晶，接近表皮細(xì)胞部分細(xì)胞較小，存在厚角組織，可以加強(qiáng)莖的韌性；維管束寬約128m，射線明顯，每個維管束之間的束間區(qū)域距離較大。初生韌皮部則位于維管束的外部，與薄壁細(xì)胞相鄰，不能明顯看出界限。初生木質(zhì)部則位于維管束的內(nèi)側(cè)，與髓部緊挨，界限也不明顯；束中形成層不太明顯，維管束正在生長延伸階段，整個形成層連接成環(huán)。以上韌皮部、木質(zhì)部和束中形成層3部分共同構(gòu)成維管束。實(shí)驗材料的髓部直徑約為1 060m，髓部相對較大，約占據(jù)整個實(shí)驗材料面積的31%。由不同大小、近似六邊形的細(xì)胞不規(guī)則排列組成，大多為薄壁細(xì)胞，髓中心的細(xì)胞相對于周圍的細(xì)胞體積更大、細(xì)胞壁更薄。

2.3 莖的粉末鑒定

葉上花的莖的干燥粉末在自然光下顯現(xiàn)為黃白色。多見草酸鈣結(jié)晶和導(dǎo)管等結(jié)構(gòu)[23]。

如圖3所示，葉上花莖的粉末顯微圖可以觀察到以下內(nèi)容：表皮細(xì)胞為不規(guī)則的多邊形，細(xì)胞壁增厚，內(nèi)含有棕色物質(zhì)，并具有紋孔。導(dǎo)管是由管胞分化而來，在葉上花木質(zhì)部中導(dǎo)管和管胞有同時存在的現(xiàn)象，二者分子短小，但導(dǎo)管數(shù)量略多于管胞，直徑可達(dá)70m。導(dǎo)管多呈具緣網(wǎng)紋狀和螺旋狀，兩端不尖銳凸起；管胞多為梯紋管胞，兩端稍凸起，直徑稍小于導(dǎo)管直徑；草酸鈣結(jié)晶呈多面不規(guī)則長方體，判斷為草酸鈣方晶，一般以單個或幾個散在的形式存在；淀粉粒較多，一般在10m以下，較大的淀粉粒可以看到層紋；韌皮部射線明顯。

圖3 葉上花莖的熒光顯微鏡粉末鑒定圖（400x）Fig.3 Stem powder identification charts of Helwingia japonica(400x)observed by the fluorescence microscope

2.4 根的橫切面顯微結(jié)構(gòu)

葉上花根整體呈圓形或近圓形，實(shí)驗材料的直徑約為1 872m，具有次生構(gòu)造，未在橫切面的顯微結(jié)構(gòu)圖中發(fā)現(xiàn)異常構(gòu)造。葉上花根的木質(zhì)部較發(fā)達(dá)，射線明顯。

如圖4所示，葉上花根的具體構(gòu)造如下，周皮為根部最外層，由小于10列的扁平的薄壁細(xì)胞連接成環(huán)，這些細(xì)胞排列規(guī)則但不緊密，木栓層存在脫落現(xiàn)象。皮層較窄，由不規(guī)則的近圓形的細(xì)胞組成。葉上花根的維管束屬于無限外韌型。初生韌皮部分化后剩余部分較少，次生韌皮部中的射線在切片中未能表現(xiàn)完全；在薄壁細(xì)胞中存在草酸鈣結(jié)晶。葉上花根的韌皮部、木質(zhì)部界限明顯，即形成層較為明顯，由數(shù)列近似方形的細(xì)胞連接成環(huán)狀。初生木質(zhì)部分化至整個根的中心部位，無髓；次生木質(zhì)部較發(fā)達(dá)，直徑可達(dá)900m，可在顯微切片圖中清楚觀察到。以上5部分共同組成一個完整的維管束結(jié)構(gòu)。實(shí)驗中用鹽基品紅 龍膽紫染色可將韌皮部染成深藍(lán)紫色，木質(zhì)部為深紅紫色。木質(zhì)部中導(dǎo)管呈類圓形，且存在木纖維。

圖4 葉上花根橫切面圖（左：100x；右：40x）Fig.4 Root cross section diagrams of Helwingia japonica(Left:100x;Right:40x)

3 結(jié)論

通過文獻(xiàn)查閱及原植物形態(tài)對比觀察，初步確定苗族習(xí)用藥材葉上花來源為山茱萸科青莢葉屬的落葉小灌木中華青莢葉[Helwingia japonica(Thunb.)Dietr.]。觀察到側(cè)根生長的部位比較靠上，在主莖上接近葉片生長的部位會出現(xiàn)側(cè)根；通過石蠟切片技術(shù)對其莖和根的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，得到莖和根的橫切面圖。觀察顯微結(jié)構(gòu)圖得知，葉上花莖和根的結(jié)構(gòu)構(gòu)造正常，主要特點(diǎn)為葉上花莖的薄壁細(xì)胞中存在草酸鈣方晶，管胞和導(dǎo)管同時存在，且導(dǎo)管多為具緣網(wǎng)紋狀，莖的韌皮部射線呈放射狀，且十分明顯，莖的木質(zhì)部沒有根的木質(zhì)部發(fā)達(dá)；根的維管束屬于無限外韌型，形成層明顯。

4 討論

目前，國內(nèi)外前期對青莢葉屬植物的研究較少，且主要集中在分離提取化合物方面，對其鑒別方面的研究鮮為報道。本實(shí)驗為了能更好地解決葉上花品種混亂問題，以葉上花顯微鑒定方法為主，對葉上花根與莖兩部分進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析，在一定程度上為葉上花的合理利用提供較為全面的依據(jù)。在實(shí)驗開展過程中，發(fā)現(xiàn)葉上花根的木質(zhì)化現(xiàn)象較嚴(yán)重，側(cè)根和主根的顯微結(jié)構(gòu)差異不明顯，故選用側(cè)根作為實(shí)驗材料。此外，在制作葉上花莖的石蠟切片時，選擇的材料應(yīng)避開木質(zhì)化現(xiàn)象嚴(yán)重的部位，這樣不僅便于切片，還有利于觀察部位的形態(tài)特征。在實(shí)驗中對染色劑、染色方法和染色順序等進(jìn)行改變，其結(jié)果并未出現(xiàn)良好的分色現(xiàn)象，尤其是葉上花莖的染色，所以染色方法仍需進(jìn)一步探究。還需注意的是，本次只是對葉上花的根和莖進(jìn)行了顯微鑒定研究，未來應(yīng)在此基礎(chǔ)上對青莢葉屬的5種不同青莢葉的莖、根和葉等分別進(jìn)行顯微鑒定研究，根據(jù)顯微結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行對比，并結(jié)合基因組和蛋白組等方面更深入地研究青莢葉屬植物，為其進(jìn)一步開發(fā)研究提供依據(jù)，進(jìn)而達(dá)到避免基源混亂的目的。