腦疏寧膠囊對小鼠的急性和長期毒性實驗觀察

劉慶義，張寰，嚴云卷，陳彤，楊媛，張梅奎

1 解放軍總醫院 遠程醫學中心，北京 100853；2 解放軍總醫院第二醫學中心 神經內科，北京 100853；3 戰略支援部隊特色醫學中心 神經內科，北京 100101

腦疏寧膠囊是解放軍總醫院中醫世家張梅奎主任歷經多年臨床研究探索出的治療腦卒中的經驗方，臨床療效確切，毒性、不良反應小[1]。該方由益母草、水蛭、三七、川牛膝等8 味中草藥組成，具有活血逐瘀，利水通腑之功效，適用于缺血性腦卒中急性期及恢復期，屬痰瘀痹阻證，癥見半身不遂、口舌歪斜、言語蹇澀或不語、偏身麻木、便干便秘、頭暈目眩、痰多而黏、舌質暗紅、苔黃膩、脈滑數等[2-4]。前期有效性研究表明，腦疏寧對腦缺血再灌注損傷大鼠恢復神經功能、降低梗死范圍、抗脂質過氧化、抑制炎癥細胞因子和黏附分子表達、抑制自由基生成和減輕創傷性腦水腫等方面的藥理作用[5-11]。前期已完成生產工藝、質量控制體系的研究工作。本研究根據中藥新藥的申報要求[12]，通過開展腦疏寧急性毒性和長期毒性實驗研究，為該藥的臨床前安全性評價、臨床劑量設計和臨床毒性、不良反應監測提供參考依據。

材料與方法

1 實驗動物 健康昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質量(20 ± 2) g，由解放軍軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK-(軍)2015-003。健康SD 大鼠120只，雌雄各半，體質量(165 ± 15) g，由解放軍總醫院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK-(軍)2015-001。動物飼養于二級屏障環境內，由獲得資格認可的人員飼養。實驗期間自由進食飲水。控制環境為溫度(23 ± 5)℃，濕度(60 ± 20)%，12 h 照明，12 h 黑暗。每天清潔籠子換墊料1 次。

2 藥物及主要儀器 0.9%氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司，批號H13023200。腦疏寧膠囊(0.5 g/粒) 由北京麥迪海藥業有限責任公司制備，批號：050618。本品成品相當于5 g(生藥)/1 g(膠囊)，臨用時用水稀釋配制成45%(以膠囊內容物計，取原料藥100 mL，稀釋至156.4 mL，濃度即為45%)的濃度備用。臨床成人日用劑量為4.5 g，按體質量60 kg計，即0.075 g/kg。低溫高速離心機(德國Heraeus 公司)；日立7020 自動生化分析儀(日本日立公司)；SYSMEX XT-2000iv 型全自動血球計數儀(日本Sysmex Corporation 公司)；CA1500全自動血凝分析儀(日本SYSMEX 公司)；多參數血細胞計數分析儀(美國JT-IR 公司)；TDL-5 臺式低速大容量離心機(江蘇金壇市醫療儀器廠)。

3 急性毒性實驗 用最大給藥量法進行急性毒性實驗[13-14]。選用昆明種小鼠40只，隨機分為實驗組和對照組，每組20只，雌雄各半，分籠飼養，禁食不禁水16 h后，實驗組按最大給藥量法灌胃1次，灌胃體積為0.8 mL/20 g，劑量為18 g/kg，此劑量相當于成人用量的240 倍。對照組給予等容量0.9%氯化鈉注射液灌胃。觀察14 d 內小鼠體質量、活動、行為、飲食、毛色等一般狀態及有無死亡，觀察主要臟器外觀形態有無異常表現。

4 長期毒性實驗 按照長期毒性實驗的有關技術要求[15-16]，將120 只健康SD 大鼠隨機分為4組，每組30只，雌雄各半，每天給藥1次，連續給藥13 周。低劑量組1.8 g/kg、中劑量組3.6 g/kg、高劑量組7.2 g/kg，對照組給予等容量0.9% 氯化鈉注射液灌胃。每天觀察動物有無死亡及其外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、毛色、飲食、二便等一般狀況，每周稱1 次體質量和飼料重。分別于給藥結束后24 h 及停藥后4周，取血測定血液學指標、血液生化學指標，剖取心、肝、腎、腦等臟器稱重計算臟器指數并進行組織病理學觀察。最后1 次給藥后24 h，每組雌、雄各取10 只脊柱脫臼法處死進行血液學、血液生化、臟器相對質量及組織病理學檢查。留下的動物繼續觀察4 周后同樣方法處死，以便了解毒性反應的恢復情況和可能出現的延遲性毒性。

5 統計學方法 使用SPSS23.0 統計學軟件對數據進行統計分析。研究資料主要為計量數據，均先行正態性檢驗。正態計量資料以表示，多組間的比較為單因素方差分析(統計量為F)+兩兩比較LSD-t檢驗(統計量為LSD-t)。重復觀測資料行重復測量方差分析(統計量為F)+兩兩組間比較LSD-t檢驗(統計量為LSD-t)+兩兩時間比較差值t檢驗(統計量為t)。統計檢驗水準α=0.05，均為雙側檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。重復測量分析及分割檢驗的多次比較按Bonferroni 校正法進行檢驗水準調整，α'=0.05/n，n 為多次比較的次數。

結果

1 急性毒性實驗 給藥后兩周內小鼠活動、行為、飲食、毛色等一般狀態未見任何異常，無死亡，主要臟器外觀未見明顯異常。實驗組不同時間的體質量變化與對照組差異無統計學意義(P＞0.05，表1)，說明腦疏寧膠囊對體質量無明顯影響。

表1 腦疏寧膠囊急性毒性實驗小鼠體質量(g,n=20)Tab.1 Body weight of mice in acute toxicity experiment of Naoshuning capsule (g,n=20)

2 長期毒性實驗

2.1 一般情況 實驗期間對照組和低、中、高3 個劑量組動物一般生理體征、行為活動、外觀體征、糞便性狀等均無異常。表2 中可以看出，給藥組與對照組動物體質量變化總體趨勢的差異無統計學意義。

表2 腦疏寧膠囊長期毒性實驗動物體質量(g,n=20)Tab.2 Body weight of mice in long-term toxicity test of Naoshuning capsule (g,n=20)

2.2 血液學指標 表3 中可以看出，高劑量組白細胞計數顯著升高(P＜0.05)，但在文獻報道檢測正常參考范圍內(2.08×109/L～ 11.78×109/L)[17]其余指標各劑量組與對照組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。給藥組血液學指標與對照組均在正常波動范圍。

表3 腦疏寧膠囊長期毒性實驗血液學指標(g,n=20)Tab.3 Hematologic indexes of long-term toxicity test of Naoshuning capsule (g,n=20)

2.3 血液生化學指示 表4 顯示，中劑量組和高劑量組大鼠血液谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST) 含量降低，高劑量組谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)含量降低，中劑量組肌酐(creatinine，CRE) 含量降低，但波動均在文獻報道檢測正常參考范圍內(雄性AST：144.50～91.42 U/L[18]，雌 性AST：136.12～ 92.46 U/L[18]，雌性ALT：50.60～ 34.6 U/L[19]，雄性CRE：53.8～30.6 μmol/L[20])。各項血液生化指標均未見明顯的異常波動。

表4 腦疏寧膠囊長期毒性實驗血液生化學指標(n=20)Tab.4 Biochemical indexes of long-term toxicity test of Naoshuning capsule (n=20)

2.4 臟器指數 從表5 可以看出，各劑量組臟器指數與對照組比較，差異多數無統計學意義(P＞0.05)。臟器指數無明顯變化。

表5 臟器指數變化表(g/100 g 體質量，n=20)Tab.5 Changes of organ indexes (g/100 g body weight,n=20)

2.5 組織病理學檢查 在給藥結束及恢復期結束時檢查動物，未發現眼瞼、結膜、角膜、前房、虹膜、瞳孔、晶狀體、眼底異常改變。對臟器組織進行病理形態學觀察結果，給藥組各臟器細胞結構均與對照組相似。

討論

本實驗設置對照組和給藥組，急性毒性實驗采用單次最大18 g/kg 劑量灌胃，此劑量相當于人擬用劑量的240 倍。關于單次最大給藥量的說明：腦疏寧膠囊原料藥濃度為1.19 g 浸膏/mL，每克浸膏含生藥3.52 g，本品制成的成品相當于5 g(生藥)/1 g(膠囊)，由此計算，5÷3.52=1.42，即1 g 膠囊相當于1.42 g 浸膏，每毫升中含的膠囊量即為1÷1.42=0.704 g。相當于膠囊內容物配制成了70.4%的濃度(因此，為方便起見，本品的濃度及給藥劑量均以膠囊內容物計算)，稱取一定量的腦疏寧膠囊原料藥，逐漸加水稀釋至相當于45%左右的濃度時，剛好能夠抽入灌胃注射器。大于此濃度時，藥液因黏稠而無法抽取，小鼠常規最大給藥體積一般控制在0.8 mL/20 g，急性毒性實驗膠囊內容物的最大濃度確定為45%，0.8×0.45÷0.02=18，即最大只能以18 g/kg 灌胃給藥，相當的生藥量為18×5=90，即相當于90 g(生藥)/kg(體質量)。本品臨床擬用劑量為4.5 g/d，60 kg 體質量人用量為4.5÷60=0.075 g/kg，因此小鼠最大給藥劑量18 g/kg 相當于人擬用劑量的倍數為18÷0.075=240 倍。給藥后兩周內動物活動、行為、飲食、毛色等一般狀態未見任何異常，無死亡現象，心、肝、脾、肺、腎及胃腸等主要臟器外觀也未見明顯異常，體質量變化也與對照組基本一致，各方面均未見明顯的急性毒性反應，提示臨床劑量安全可靠，并為后續長期毒性實驗劑量設計提供參考依據。

長期毒性實驗給藥途徑為灌胃，與人臨床擬用途徑相同，給藥體積以最大給藥體積2 mL/100 g 體質量計算。本實驗低、中、高劑量分別為1.8 g/kg、3.6 g/kg、7.2 g/kg，分別相當于臨床劑量的24 倍、48 倍、96倍，最小劑量大于藥效學大劑量，其他劑量等比設計。高劑量組已經達到臨床劑量的90 倍以上，以2 mL/100 g 體質量的給藥體積灌胃，能夠達到在長期大劑量下觀察其安全性的目的[21-23]。

給藥結束24 h 以及停藥后4周，動物外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、毛色、體質量、飲食、二便等一般狀況均未見異常，血液學和血液生化指標檢查也未見異常波動，主要臟器外觀、濕重指數以及組織病理學觀察與對照組比較，差異無統計學意義，表明沒有明顯的長期毒性反應，安全性較高。因此，腦疏寧膠囊并無明顯靶器官毒性。

綜上所述，腦疏寧膠囊急性毒性實驗和長期毒性實驗各方面均未出現明顯的毒性反應，表明腦疏寧膠囊按臨床擬用劑量長期服用具有較高的安全性，為臨床應用的安全性評價、臨床劑量設計和臨床毒性、不良反應監測提供了科學依據，其適應證是以發病率高、致殘率高、病死率高、復發率高和并發癥多等為特點的腦卒中[24-25]，腦卒中是嚴重威脅人民健康和生活的三大常見疾病之一。因此，本品有望成為一個具有良好開發前景的中藥新藥。