沖擊波對糖尿病慢性創面微環境下HaCat 細胞增殖及遷移的影響

康靖汶，盛煒，甕長水，李美蓉，羅蕓，張麗

1解放軍總醫院第二醫學中心 康復醫學科，北京 100853；2 解放軍總醫院第二醫學中心 國家老年疾病臨床醫學研究中心，北京 100853；3 解放軍醫學院，北京 100853；4 解放軍總醫院第一醫學中心 組織再生與創面修復科，北京 100853；5 解放軍總醫院醫學創新研究部，北京 100853；6 解放軍總醫院第二醫學中心 老年醫學研究所，北京 100853

隨著社會和經濟的快速發展，糖尿病已經成為造成體表慢性創面的首要原因[1]。慢性創面治療困難，花費巨大，嚴重影響患者健康狀態、降低其生活質量，正在成為社會和家庭的重要負擔。積極探索新型治療方法，提高慢性創面愈合率，具有重要的臨床、經濟及社會價值[1]。體外沖擊波療法(extracorporeal shock wave therapy，ESWT)已在骨肌疾病臨床治療領域廣泛應用[2]，但在創面治療中的應用尚屬較新領域[3]。臨床研究初步證實，ESWT 可促進糖尿病足創面、壓力性潰瘍等慢性創面愈合[4-5]，但其機制有待深入研究。在創面愈合過程中，皮膚基底層表皮細胞的增殖和遷移功能對創面的成功上皮化具有重要作用[1]。本研究擬觀察沖擊波(shock wave，SW)對離體條件下糖尿病慢性創面(chronic diabetic wound，CDW)微環境中HaCat 細胞(人表皮角質形成細胞)增殖和遷移能力的影響，嘗試從細胞水平探討ESWT 促進CDW 愈合的作用機制。

材料與方法

1 實驗細胞 人表皮角質形成細胞(human keratinocyte cell line，HaCat；細胞編號：3111C0001 CCC000373)，購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

2 主要試劑與儀器 MEM-EBSS(minimum essential medium eagles with earle’s balanced salts)培養基，美國Sigma-Aldrich 有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，美國Gibco 公司；青霉素/鏈霉素液，中國南京凱基生物科技發展有限公司；胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)，中國南京拜睿生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，中國北京索萊寶生物科技有限公司；葡萄糖溶液，美國Gibco 公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)，中國北京索萊寶生物科技有限公司；絲裂霉素C，美國Sigma-Aldrich 有限公司；96 孔細胞培養板及6 孔細胞培養板，美國Corning公司。

Dolor-Clast 型放散式體外沖擊波治療設備，瑞士EMS 公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺，江蘇蘇州凈化設備有限公司；HF151 型CO2細胞培養箱，上海力申科學儀器有限公司；XD-RFL 型生物相差倒置顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；80-2型臺式低速離心機，上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠。

3 細胞分組 細胞分為5組，其干預方法如下。1)對照組：用葡萄糖濃度5 mmol/L 的MEM-EBSS培養基，模擬正常HaCat 細胞；2) CDW 組：通過高糖低氧孵育條件模擬糖尿病慢性創面微環境，建立糖尿病慢性創面細胞模型；3) SW1 組：針對糖尿病慢性創面細胞模型，進行沖擊波干預，能流密度(energy flux density，ED) 0.05 mJ/mm2，500脈沖，頻率8 Hz/s；4) SW2 組：針對糖尿病慢性創面細胞模型，進行沖擊波干預，ED 0.10 mJ/mm2，500 脈沖，頻率同上；5) SW3 組：針對糖尿病慢性創面細胞模型，進行沖擊波干預，ED 0.10 mJ/mm2，1 000 脈沖，頻率同上。

4 HaCat 細胞培養 HaCat 細胞培養于含10%胎牛血清、5 mmol/L 葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的MEM 培養基中，在恒溫培養箱中以5% CO2、37℃以及飽和濕度條件下松蓋培養，每2～ 3 d 換液1次，80% 鋪滿時進行消化、傳代，直至第3 代(P3)。

5 細胞模型建立 HaCat 細胞培養于含10%胎牛血清、25 mmol/L 葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的MEM 培養基中，低氧狀態采用混合缺氧氣體預充方式(1% O2，5% CO2，94%N2)，利用簡易輸液袋將培養好的HaCat 細胞培育瓶或培育板放入其中，用封口機密封后真空泵抽空袋內空氣，隨后將混合缺氧氣體灌入袋中，保證輸液袋內為含1% O2的缺氧氣體，隨后將輸液袋放入5% CO2、37℃恒溫培養箱中繼續孵育相應時間[6-7]。

6 沖擊波干預方法 取對數生長期的HaCat 細胞，胰酶消化、離心，調整為適宜的細胞濃度，采用放散式沖擊波治療設備，將36 mm 沖擊波探頭采用環氧乙烷進行滅菌消毒后，在嚴格無菌的條件下，根據各組不同干預參數，對HaCat 細胞懸液進行沖擊波干預[8]。

7 HaCat 增殖能力測定 采用CCK-8 試劑盒檢測HaCat 細胞增殖能力。方法如下：取對數生長期的HaCat 細胞，胰酶消化、離心，調整細胞濃度為l × 104/mL，進行ESWT 干預；將ESWT 干預后的HaCat 細胞懸液200 μL 加入到96 孔細胞培養板中，每孔2 000 個細胞，每組設8 個復孔；在37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，在每孔加入CCK-8 溶液10 μL，在細胞培養箱內孵育3 h；采用全自動酶標儀在450 nm 測定吸光度(optical density，OD)，其細胞增殖能力與吸光度成正比。檢測時間為ESWT 干預后1 d、2 d、4 d、6 d、8 d。

8 HaCat 遷移能力測定 采用細胞劃痕試驗，方法如下：取對數生長期的HaCat 細胞，胰酶消化、離心，調整細胞濃度為5 × 105/mL，進行ESWT 干預；于6 孔板加入ESWT 干預后的細胞混懸液，每孔1.5 mL，于37℃、5% CO2培養箱中孵育12 h；PBS 清洗，加入含20 μg/mL 絲裂霉素C 的1640 培養基1.5 mL，繼續于CO2培養箱中孵育12 h；取出6 孔板，用50 μL Tip 頭比著直尺，垂直于孔板底部在單層貼壁細胞上劃出劃痕；PBS 清洗2次，去除脫落的細胞；加入MEM 培養基，于CO2培養箱中孵育，分別于0 h、12 h、24 h 用倒置相差顯微鏡觀察細胞遷移情況，記錄劃痕寬度，拍照取樣。每組設6 個復孔。用Image J 軟件測量各時間點愈合劃痕面積，并計算劃痕愈合率，公式如下：

細胞劃痕愈合率=(1-劃痕面積/最初劃痕面積) × 100%。

9 統計學方法 使用SPSS23.0 統計學軟件進行統計分析。本研究數據主要為多組、多時間點觀測的計量資料，均滿足正態性分布，以表示。采用兩因素重復測量方差分析+兩組間比較LSD-t檢驗+組內兩時點比較差值t檢驗。統計檢驗水準α=0.05，均為雙側檢驗。其中差值t檢驗屬多次比較，按Bonferroni 校正法進行檢驗水準調整，α'=0.05/n，n 為多次比較的次數。

結果

1 不同干預條件對HaCat 細胞形態的影響 通過倒置相差顯微鏡觀察，可見對照組HaCat 細胞呈梭形或多邊形外觀，胞液透明，排列緊湊，邊界清楚；CDW 組HaCat 細胞形態未見異常，胞內可見密集、高亮折光點；不同劑量SW 組HaCat 細胞形態均未見異常，胞液清亮透明，與對照組比較無明顯差異。見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下不同干預組HaCat 細胞形態Fig.1 Morphological changes of HaCat cells in different groups under inverted phase contrast microscope

2 ESWT 干預對HaCat 細胞增殖活性的影響CCK-8 試驗結果列示于下。經兩因素重復測量方差分析，整體組間、組內(時間)及交互作用，差異均有統計學意義(P＜0.05)。兩兩精細比較并結合主要數據分析：

1) ESWT 干預對HaCat 細胞增殖活性的影響：孵育1 d時，各組HaCat 細胞增殖活性無統計學差異(P＞0.05)；孵育2 d時，SW2 組細胞增殖活性增加明顯，其OD450值：SW2 組＞SW1 組＞對照組＞SW3 組＞CDW 組(P＜0.05)；孵育4 d時，各組細胞增殖活性均有增加，以SW2 組最為明顯，其OD450值：SW2 組＞對照組＞SW1 組＞CDW 組＞SW3 組(P＜0.05)；孵育6 d時，SW2 組和SW1 組細胞增殖活性增長明顯，OD450值：SW2 組＞SW1 組＞SW3 組＞對照組＞CDW 組(P＜0.05)；孵育8 d時，各組細胞增殖活性顯著下降，但仍以ESWT 干預組更強(P＜0.05)，提示不同處理對細胞增殖活性的影響顯著。見表1。

2)不同孵育時間HaCat 細胞增殖活性的變化：HaCat 細胞增殖活性呈現出早期增加、后期下降的趨勢，具體表現：干預后2 d，除CDW 組外，各組細胞增殖活性開始增加，之后增殖速度明顯加快，在干預后6 d 達到增殖高峰，在干預后8 d 增殖活性顯著下降，其OD450值：Day6＞Day4＞Day8＞Day2＞Day1，Day2 及其后各時點與Day1 比較差異有統計學意義(P＜0.01)，各組表現為相似的變化趨勢和特征，尤以ESWT 干預組最明顯。見表1。

表1 各組HaCat 細胞增殖活性(OD450)Tab.1 Proliferation ability of HaCat cells in different groups by CCK-8 (OD450)

綜合來看，不同劑量的ESWT 干預及孵育時間均對HaCat 細胞的增殖活性具有顯著影響。3 沖擊波干預對HaCat 細胞遷移能力的影響 沖擊波干預對HaCat 細胞遷移能力的影響列示于下。亦經兩因素重復測量方差分析，整體組間、組內(時間) 及交互作用，差異均有統計學意義(P＜0.05)。兩兩精細比較并結合主要數據分析：各組HaCat 細胞劃痕愈合率均隨時間延長逐漸增加；劃痕12 h 及24 h時，各組劃痕愈合率：SW2 組＞SW1 組＞SW3 組＞對照組＞CDW 組(P＜0.05)。見圖2、表2。

表2 不同干預組HaCat 細胞劃痕愈合率(%,n=6)Tab.2 Healing rate of HaCat cells in different groups by scratch assay (%,n=6)

圖2 倒置相差顯微鏡下不同干預組HaCat 細胞遷移能力Fig.2 Migration ability of HaCat cells in different groups by scratch assay under inverted phase contrast microscope

討論

慢性創面是一大類長期不愈或難愈的組織損傷，國際創面愈合學會將其定義為無法通過正常有序而及時的修復過程，達到解剖和功能上完整狀態的創面[1]。

創面愈合是一個復雜而有序的生物學過程，涉及多種修復細胞、炎癥細胞、炎癥介質、細胞因子和細胞外介質等的共同參與，其中任何環節出現異常，都可能導致創面的延遲愈合或不愈合[9]。在此過程中，基底層表皮細胞不斷增殖并向上遷移，并最終形成創面再上皮化，這是實現創面成功修復的關鍵步驟，因此表皮細胞的活性及功能對創面的愈合過程甚為重要[1,3]。而在糖尿病高糖微環境中，多種細胞的增殖能力受到抑制[10-11]，創面局部表皮細胞也會數量減少、活性下降，創面再上皮化的進程受阻，從而延遲創面的愈合[12-13]。因此，重新激活糖尿病慢性創面微環境中表皮細胞的活性和功能，對加速糖尿病慢性創面的愈合具有重要意義。

本研究中選用的HaCat 細胞來自于正常人皮膚的永生化表皮細胞，具有增殖能力強、細胞培養條件簡單等優點；根據文件檢索[6]和前期預實驗，選擇高糖低氧孵育條件模擬糖尿病慢性創面局部微環境，其方法簡便可行，HaCat 細胞形態未見顯著改變，但細胞的增殖和遷移功能受到明顯抑制，較為客觀地反映了糖尿病慢性創面中表皮細胞的功能狀態和生物學特征，保障了本研究的順利實施。

ESWT 是利用沖擊波的機械能量進行疾病治療與康復的新型物理療法[14]，具有非侵入、安全、有效的特點，在難愈性骨折、骨不連、肌腱末端病等肌肉-骨骼系統損傷或疾病的治療中廣泛應用[14-15]。近年來，ESWT 治療領域不斷拓展，在年齡相關性退行性病變的治療(如肌少癥、骨質疏松癥等)、創傷修復、再生醫學領域也顯示出獨特優勢[4,16-17]。現有臨床證據初步證實，作為一種新型慢性創面的輔助治療方法，ESWT 具有良好的臨床應用前景[4-5]，但其作用機制尚不明確。相關研究表明，沖擊波的機械能量可能促進新生血管的形成和微循環改善[18-19]、調節局部炎癥反應、刺激堿性成纖維細胞生長因子、基質細胞衍生因子、內皮生長因子等生長因子的表達[18,20]、誘導干細胞的增殖和多向分化等一系列生物反應[21]，被認為是ESWT 促進慢性創面愈合效果的重要機制[22-23]。

細胞學研究證實，沖擊波的機械能量可以刺激成纖維細胞[24-26]、成骨細胞、肌腱細胞、間質祖細胞[22]、骨髓干細胞、脂肪干細胞[22]、肌腱干細胞[27]等的增殖、遷移和(或)分化過程。目前尚無沖擊波應用于表皮HaCat 細胞的相關研究。

本研究觀察了不同劑量沖擊波對糖尿病慢性創面微環境中人表皮HaCat 細胞形態以及增殖和遷移能力的影響，結果發現，與對照組相比，CDW 組HaCat 細胞的增殖和遷移能力均受到明顯抑制，而沖擊波作用后，HaCat 細胞的增殖和遷移能力顯著增強，其增殖效應在干預后6 d 達到高峰。上述結果提示沖擊波對HaCat 細胞的生物學效應，這可能是ESWT 促進慢性創面愈合的重要作用機制之一。在臨床研究中，我們也觀察到ESWT 治療后，慢性創面再上皮化速度明顯加快，佐證了ESWT 治療機制可能與創面周圍組織中表皮細胞的功能增強有關[5]。通過細胞實驗與臨床研究的結果相互印證，將為ESWT 在創面修復和再生醫學領域的應用提供理論依據。

能流密度是反映沖擊波能量的重要參數，描述單位面積沖擊波能量的集中度[2]。根據2019年中國研究型醫院學會沖擊波醫學專業委員會制定的《中國骨肌疾病體外沖擊波療法指南》[2]：按能量等級，將沖擊波劃分為低、中、高3 個能級：低能量范圍為0.06～ 0.11 mJ/mm2，中能量范圍為0.12～ 0.25 mJ/mm2，高能量范圍為0.26～0.39 mJ/mm2。據此標準，本研究中所選擇的沖擊波能流密度均為低能量范圍，具體輸出劑量：SW3 組(0.10 mJ/mm2，1 000 脈沖)＞SW2 組(0.10 mJ/mm2，500 脈沖)＞SW1 組(0.05 mJ/mm2，500 脈沖)；而進一步比較不同劑量沖擊波對HaCat 細胞的生物學效應，結果發現SW2 組細胞的增殖和遷移能力增強最為明顯，SW1 組次之，SW3 組低于前兩組，提示在較低劑量沖擊波作用時，對細胞促增殖效應更加明顯，其中0.10 mJ/mm2、500 脈沖的干預劑量效果最佳；而在較高劑量的沖擊波作用時，對細胞的促增殖效應相對減弱。該結果與既往基礎和臨床研究的結果一致，即過高能量的沖擊波作用時，局部組織可能出現損傷性或抑制性反應[19]。上述劑量-效應關系將對ESWT 臨床應用于慢性創面具有指導作用。

需要注意的是，創面愈合過程非常復雜，涉及到多種細胞類型和生物學過程，除表皮細胞的功能外，成纖維細胞、內皮細胞的增殖活性和功能、新生血管以及基質合成等生物學過程的參與亦非常重要。而本研究中，僅涉及沖擊波對表皮細胞的作用和特點，而對其他細胞及生物學過程的效應研究還有待開展；另一方面，在分子生物學水平上，沖擊波促進慢性創面愈合的信號通路和作用機制也有待更為深入的研究。