喜樹堿衍生物N- 乙酰- Asp- Gly- CPT 的藥代動力學研究

姜永紅

（東北林業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

喜樹堿（Camptothecin，CPT）是一種單萜類的吲哚生物堿，從我國珙桐科植物喜樹（Camptotheca acuminata）的提取物中分離獲得。喜樹堿是拓撲異構酶Ⅰ的抑制劑，具有廣譜抗腫瘤活性[1-5]。體內研究顯示，喜樹堿具有嚴重的副作用，包括會抑制骨髓的活力、刺激胃腸道引起不適以及延遲性腹瀉[6，7]，而且不經修飾的喜樹堿存在溶解性差、體內吸收差、活性結構不穩定等問題。為了獲取活性更高、毒副作用更小的喜樹堿衍生物，研究人員對喜樹堿進行結構修飾，已經應用于臨床癌癥治療進程的有伊立替康（CPT-11）[8，9]、拓撲替康(Topotecan, TPT)[10]及9- 氨基喜樹堿(9-amino- camptothecin,9-AC )[11，12]等。

N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 是本實驗室在喜樹堿的-20 位羥基引入了甘氨酸和天冬氨酸所合成的喜樹堿衍生物（圖1），使用甘氨酸酯的空間位阻效應提高了內酯環的穩定性，提高母體喜樹堿的溶解性及可吸收性，對于喜樹堿的腸道吸收具有積極作用。

圖1 喜樹堿和N- 乙酰-CPT-Gly-Asp 的結構式

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器儀器

高效液相色譜（美國Waters 公司）；Sorvall Legend Micro 17 型離心機（美國Thermo 公司）；WH-986 靜音混合器和WH-861 漩渦混合器（江蘇省太倉市科教器材廠）；Luna C18 柱色譜柱（美國phenomenex 公司）。Sorvall Legend Micro 17 型離心機（美國Thermo 公司）；WH-986 靜音混合器 和WH-861 漩渦混合器（江蘇省太倉市科教器材廠）等。喜樹堿（純度99%），購自哈爾濱峰源高科技開發有限公司。N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 為實驗室合成（純度99%）。SPF級大鼠（300 ± 30 g），購于長春億斯動物技術有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 血漿樣品的采集

精確稱取N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 各10 mg，分別溶解于10 mL DMSO 中，并用乙腈稀釋到400、200、100、80、40、20、10 ng/mL 的工作溶液，置于-40℃冰箱中保存。其中，四個濃度的質量控制樣品（QC）分別為 5 ng/mL、10 ng/mL（低濃度）、100 ng/mL（中濃度）和300ng/mL（高濃度）。

給藥前，稱取適量N- 乙酰-Asp-Gly-CPT，使用注射溶液（DMSO/PEG-400/0.01 mol/L H3PO4= 5/45/50，v/v/v）溶解混勻，獲得濃度為2 mg/mL 的N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 懸濁液。

選取3 只健康雄性Wistar 大鼠，體重（300±30）g，使用10%的水合氯醛腹腔麻醉后進行頸脈插管。次日實驗前稱量大鼠的體重，以3mg/kg 劑量進行尾靜脈注射，于給藥后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 和48 h 取血，將血液置于預先用肝素處理過的離心管中，于4℃、3000 rpm·min-1離心30 min，取上清，并向上清血中加入等體積的0.1M HCl 溶液，混合均勻后置于-80℃冷凍保存。

1.2.2 樣品處理

向50 μL 血 漿 樣 品 中 依 次 加 入50 μL 0.1M HCl、100μL 乙腈和50μL 內標溶液（CZ44, 100 ng/mL），混合均勻后加入100μL 的1% 乙酸乙腈和500μL 乙酸乙酯，渦旋10 min，13000 rpm/min 離心10 min。取600μL 上清液置于新的離心管內，于氮吹儀中吹干。加入200μL 乙腈復融，室溫渦旋10 min，13000 rpm/min 離心，取上清190μL 加入到進樣瓶中檢測。

1.2.3 標準曲線的制備

按照“1.2.2”樣品制備方法制備標準曲線樣品，以測得的N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 的峰面積與內標比值為縱坐標（y），N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 的濃度為橫坐標（x），使用最小二乘法進行回歸運算。

1.2.4 血藥濃度測定

根據標準曲線計算各時間點樣品的血藥濃度，得到藥物濃度- 時間曲線。使用藥代動力學軟件Kinetica 5.0 計算藥代動力學參數。

2 結果與討論

2.1 色譜條件

使用Waters 高效液相色譜系統（HPLC），1525 梯度泵、2475 型熒光檢測器、717 型自動進樣器。所用色譜柱為Luna C18 柱。流動相A 為0.1% 的乙酸水，流動相B 為ACN，高效液相色譜系統的流速為1.2 mL·min-1，樣品進樣體積為30μL，系統的運行時間為25 min。梯度洗脫條件見表1。2475 熒光檢測器激發波長為 380nm，發射波長為418 nm。

表1 HPLC 法測定N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 流動相梯度洗脫條件

2.2 標準曲線的制備

求得標準曲線回歸方程為y=0.0053x+0.0017，R2=0.9984，濃度范圍為10～400ng/mL。

2.3 血藥濃度測定

圖 2 是大鼠尾靜脈給藥 3 mg/kg N- 乙酰-Asp-Gly-CPT (2mg/mL) 后，N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 及其主要代謝產物CPT 在血漿中的分布情況，如圖所示，尾靜脈給藥后，血漿樣品中可立即檢測到N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT，且給藥后，N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 立即達到最大濃度；但在隨后迅速下降，在8h 之后基本檢測不到。CPT 的血藥濃度呈現先上升后下降的趨勢，并且濃度明顯低于N- 乙酰-Asp-Gly-CPT。

圖2 N- 乙酰-Asp-Gly-CPT（左）和CPT（右）的血藥濃度- 時間曲線

使用藥代動力學軟件Kinetica 5.0 計算藥代動力學參數，結果見表2。藥物在大鼠體內的藥動學過程參照非房室模型。尾靜脈給藥后，N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 的藥峰濃度Cmax 是69.75±4.66 ng/mL，約是CPT（2.69±0.54ng/mL）的27 倍；N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 在給藥后立即達到峰值，這可能是由于N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 進入體內后迅速代謝，導致采集血液樣品時已經達到最大血藥濃度。N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 的半衰期T1/2 分別為2.93±0.93h 和5.39±0.27 h，平均駐留時間MRT 分別是5.43±1.05 h 和6.95±0.40 h，這說明N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 在大鼠血漿中的較為穩定，不會快速代謝；尾靜脈給藥后N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 的AUC0-24和AUC0-∞分別為 101.77±55.16 h·ng·mL-1和159.87±71.62 h·ng·mL-1，相應CPT 的分別為26.34±15.73 h·ng·mL-1和34.29±23.96 h·ng·mL-1。

表2 大鼠尾靜脈給藥3mg/kg N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 后N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和HCPT 的藥代動力學參數(n=5)

3 結論

本文建立了一種同時測定大鼠血漿中N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 及其代謝產物CPT 的HPLC 方法，并將這種測定方法應用于Asp-Gly-CPT 在大鼠體內的藥代動力學研究分析中。經考察大鼠尾靜脈給藥后的藥代動力學參數，得出N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 進入體內后迅速達到最大血藥濃度。N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 的T1/2和MRT 均較長，說明N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 在大鼠血漿中的較為穩定，不會快速代謝。