miR-146a及MUC5AC在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織中表達的相關性及臨床意義

史志芳 徐 泳 姜 微

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitiswith nasal polyps，CRSwNP)是臨床常見疾病，以鼻塞流涕、嗅覺減退等癥狀持續12周為主要臨床表現。鼻-鼻竇黏膜慢性炎癥是該病基本的病理特征，慢性炎癥能夠促進黏膜內杯狀細胞增生、引起黏液分泌增多。黏蛋白5AC(mucin 5AC，MUC5AC)是鼻腔及鼻竇黏液的主要成分，大量生成的MUC5AC會造成鼻腔及鼻竇內黏液引流障礙、刺激膿性分泌物產生，進而促使CRSwNP病情發展[1-2]。目前ECRSwNP發病過程中黏液分泌增多的調控機制尚不十分清楚，臨床上也缺乏能夠準確評估病情的標志物。Yan等[3]的研究證實，微小RNA(microRNA，miR)-146在鼻黏膜上皮細胞中通過靶向抑制表皮生長因子受體(epidermal growth factor，EGFR)的表達減少MUC5AC，提示miR-146可能參與CRSwNP發病過程中MUC5AC生成的調控。基于此，本研究以CRSwNP患者為對象，探究miR-146a及MUC5AC在CRSwNP組織中表達的相關性及臨床意義，旨在初步探索CRSwNP的發病機制和CRSwNP病情的評估標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年10月至2020年10月在江蘇省徐州市中醫院接受鼻內鏡手術治療的80例CRSwNP患者，納入標準：①符合指南中CRSwNP的診斷標準[4]；②臨床病理資料完整；③均留取鼻息肉組織待測。排除標準：①術前1個月局部或全身使用過糖皮質激素；②合并變應性鼻炎、哮喘、真菌性鼻-鼻竇炎等疾病。根據術后病理結果、參照《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[4]，將嗜酸性粒細胞型CRSwNP患者納入ECRSwNP組(n=38)、非嗜酸性粒細胞型CRSwNP患者納入non-ECRSwNP組(n=42)。另取同期因鼻外傷、鼻中隔偏曲、單純鼻竇囊腫接受手術治療的28例患者作為對照組，均排除鼻部炎癥性疾病。3組患者性別、年齡比較，差異無統計學意義。參照《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[4]進行視覺模擬量表(visual analog scale，VAS)癥狀評分、鼻內鏡評分、CT評分的比較差異均有統計學意義。見表1。

表1 3組研究對象臨床特征比較

1.2 研究方法

1.2.1 組織中miR-146a表達的檢測 取ECRSwNP組和non-ECRSwNP組患者的鼻息肉組織、對照組患者的鼻黏膜組織，采用miR提取分離試劑盒(北京天根公司)分離組織中的miR，采用miR cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根公司)進行反轉錄反應、合成miR對應的cDNA，采用miR熒光定量檢測試劑盒進行PCR檢測，按照試劑盒說明書配置反應20 μL的體系，分別使用miR-146a及U6的特異性引物，在PCR儀上進行40個循環的擴增反應，根據循環曲線計算miR-146a的表達水平。

1.2.2 組織中MUC5AC表達的檢測 取ECRSwNP組和non-ECRSwNP組患者的鼻息肉組織、對照組患者的鼻黏膜組織，加入RIPA裂解液(上海碧云天公司)后勻漿提取蛋白，采用BCA試劑盒(上海碧云天公司)檢測蛋白含量，將含有20 μg蛋白的樣本用于MUC5AC表達的檢測。將樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳、電轉PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫孵育1 h，1∶1 000稀釋的MUC5AC一抗(Abcam公司)或1∶3 000稀釋的β-actin一抗(Sigma公司)4℃孵育過夜，1∶2 000稀釋的二抗(Abcam公司)室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統(上海勤翔公司)中顯影得到MUC5AC及β-actin的蛋白條帶，根據條帶灰度值計算表達水平。

1.2.3 鼻息肉組織炎癥細胞浸潤的評價 根據病歷資料中CRSwNP患者鼻息肉組織病理切片的HE染色結果進行鼻息肉組織炎癥細胞浸潤評價，在400×顯微鏡下隨機觀察5個視野中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞的數目，計算各種炎癥細胞的百分比。

1.2.4 疾病嚴重程度的評價 參照《慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南》[4]采用VAS癥狀評分、內鏡評分、CT評分。VAS癥狀評分從鼻塞、瘤體、頭痛或頭暈、面部脹痛、嗅覺減退5個項目進行癥狀評價，每個項目0～2分、總分10分，得分越高、癥狀越重；根據Lund-Kennedy標準從息肉、水腫、鼻漏、瘢痕、結痂5個方面進行鼻內鏡評分，每個指標0～2分，兩側分別計分，總分20分，得分越高，病情越重；根據鼻竇軸位+冠狀位高分辨率CT檢查結果分別對雙側額竇、前篩、后篩、上頜竇、蝶竇、竇口鼻道復合體進行評分，每個項目0～2分、兩側分別計分、總分24分，得分越高、影像學嚴重程度越重。

1.3 觀察指標 記錄并比較3組患者miR-146a、MUC5AC表達水平的差異，分析miR-146a、MUC5AC表達水平與炎性細胞百分比、VAS評分、CT評分、內鏡評分的相關性，以及miR-146a、MUC5AC表達水平對ECRSwNP的診斷價值。

2 結果

2.1 3組研究對象miR-146a、MUC5AC表達水平比較 3組研究對象miR-146a、MUC5AC表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；經兩兩比較，ECRSwNP組、non-ECRSwNP組鼻息肉組織中miR-146a的表達水平低于對照組，MUC5AC的表達水平高于對照組(P<0.05)。ECRSwNP組鼻息肉組織中miR-146a的表達水平低于non-ECRSwNP組，MUC5AC的表達水平高于non-ECRSwNP組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 3組研究對象MUC5AC的蛋白條帶

表2 3組研究對象miR-146a、MUC5AC表達水平的比較

2.2 鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平的相關性 鼻息肉組織中miR-146a的表達水平與MUC5AC的表達水平均具有負相關關系(r=-0.7957、P<0.001)。見圖2。

圖2 鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平的相關性

2.3 鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平與炎性細胞百分比的相關性 鼻息肉組織中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的百分比分別為9.49(7.96, 34.21)%、(7.69±1.32)%、(5.53±0.93)%。經Spearman檢驗，鼻息肉組織中miR-146a的表達水平與嗜酸性粒細胞百分比呈負相關(P<0.05)，MUC5AC的表達水平與嗜酸性粒細胞百分比呈正相關性(P<0.05)；經Pearson檢驗，miR-146a、MUC5AC的表達水平與中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比無相關關系(P>0.05)。見表3。

表3 鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平與炎性細胞百分比的相關性

2.4 鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平與疾病嚴重程度的相關性 CRSwNP患者的VAS評分、CT評分、內鏡評分分別為4(3,5)分、9(6, 12)分、6(4, 7)分。經Spearman檢驗，鼻息肉組織中miR-146a的表達水平與VAS評分、CT評分、內鏡評分呈負相關關系(P<0.05)，MUC5AC的表達水平與VAS評分、CT評分、內鏡評分呈正相關關系(P<0.05)。見表4。

表4 鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平與疾病嚴重程度的相關性

2.5 鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平診斷ECRSwNP的分析 以術后病理學結果作為診斷ECRSwNP的金標準，鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平診斷ECRSwNP的ROC曲線下面積為0.848(95%CI：0.759～0.937，P<0.001)，見圖3A；0.703(95%CI：0.588～0.819，P=0.002)，見圖3B。

圖3 鼻息肉組織中miR-146a、MUC5AC表達水平診斷ECRSwNP的ROC曲線

3 討論

黏液過度分泌是CRSwNP的重要特征之一。黏蛋白是由上皮杯狀細胞和黏膜下腺體細胞表達并分泌的一類具有豐富糖基化的蛋白，黏液中豐富的黏蛋白會造成黏性和彈性增加，進而在CRSwNP的發病過程中引起竇口阻塞、刺激鼻黏膜并加重病情[5-6]。MUC5AC是氣道中主要的黏蛋白類型，國內外多項研究報道，CRSwNP組織中MUC5AC的表達明顯增多[1-2, 7-8]。本研究也發現，ECRSwNP及non-ECRSwNP患者鼻息肉組織中MUC5AC的表達明顯增多，與上述研究結果吻合，表明MUC5AC的高表達可能與CRSwNP的發病有關。

ECRSwNP及non-ECRSwNP是CRSwNP的兩種不同亞型，目前認為伴有嗜酸性粒細胞浸潤的ECRSwNP較不伴有嗜酸性粒細胞浸潤的non-ECRSwNP具有更高的臨床疾病嚴重程度及術后復發風險[9-11]。本研究發現ECRSwNP鼻息肉組織中MUC5AC的表達水平高于non-ECRSwNP，且MUC5AC的表達水平與嗜酸性粒細胞百分比、VAS評分、CT評分、內鏡評分均具有正相關關系，表明MUC5AC高表達可能在CRSwNP的病情加重過程中起到作用，結合相關性結果進行分析，嗜酸性粒細胞的浸潤可能促進了MUC5AC的表達，MUC5AC的高表達引起竇口阻塞、刺激鼻黏膜并增加嗜酸性粒細胞浸潤、加重病情，患者出現了更高的VAS評分、CT評分、內鏡評分，進而提示減少MUC5AC表達及分泌可能成為防治CRSwNP的靶點。

miRNA是一類非編碼RNA，在轉錄后水平調節多種基因表達并發揮廣泛的生物學作用[12]。miR-146a是具有抗炎作用的miRNA，Yan等[3]的研究證實該miRNA參與MUC5AC表達的調控，在鼻黏膜上皮細胞中miR-146a靶向抑制EGFR的表達并減少MUC5AC。本研究分析發現：CRSwNP中miR-146a的表達水平明顯降低，且ECRSwNP鼻息肉組織中miR-146a的表達水平低于non-ECRSwNP；進一步進行相關性分析可知：CRSwNP中miR-146a的表達水平與MUC5AC及嗜酸性粒細胞百分比、VAS評分、CT評分、內鏡評分呈負相關，與細胞實驗中miR-146a減少MUC5AC生成的作用吻合，提示低表達的miR-146a可能通過增加MUC5AC參與CRSwNP的發病、造成CRSwNP病情加重，與之相關的機制可能是低表達的miR-146a直接增加嗜酸性粒細胞浸潤及MUC5AC表達，也可能存在嗜酸性粒細胞浸潤與MUC5AC表達的相互促進作用，但具體的機制仍有待更多的基礎實驗來驗證。本研究經ROC曲線分析發現，miR-146a及MUC5AC對ECRSwNP及non-ECRSwNP具有鑒別作用，可能為CRSwNP病情評估的標志物。

綜上所述，本研究結果表明，miR-146a低表達、MUC5AC高表達與CRSwNP的發病及病情加重有關，miR-146a可能參與CRSwNP發病過程中MUC5AC表達、嗜酸性粒細胞浸潤的調控，未來miR-146a有望成為研究CRSwNP發病機制、病情評估標志物的新靶點。但本研究主要通過相關性分析來推測miR-146a及MUC5AC在CRSwNP發病中的作用，具有一定的局限性，今后應通過動物實驗、細胞實驗等基礎研究方案來驗證miR-146a在CRSwNP發病過程中對MUC5AC及嗜酸性粒細胞浸潤的直接調控作用。