高溫-復合酶法改性小米糠膳食纖維工藝優化及結構與功能分析

丁彩云，糟 帆，馬玉婷，劉 軍，劉敦華，傅 婧

(寧夏大學食品與葡萄酒學院，銀川 750021)

小米糠是小米加工脫殼后的副產物，營養成分豐富[1]，尤其膳食纖維(DF)質量分數在18%以上[2]。目前大部分小米糠只是直接或經過粗加工后用作畜禽飼料，產品附加值很低。

研究表明膳食纖維具有降糖降脂、調節血壓、調節腸道菌群、提高免疫力等生理功能[3]。根據在水中的溶解程度，DF分為可溶性膳食纖維(SDF)與不可溶性膳食纖維(IDF)，相比IDF，SDF具有更多的功能特性[4]。因此，通過膳食纖維改性來制備SDF具有現實意義。DF的改性方法主要有物理、生物和化學改性。化學改性可以在一定程度上改善膳食纖維的結構，但化學試劑的引入可能會給人體帶來安全隱患。物理-生物改性工藝簡單、反應條件溫和、專一性強、對設備要求低且環境友好，從而具有良好研究前景。Song等[5]通過擠壓后在纖維素酶20 U/g，pH 4.5，溫度為50 ℃下持續處理240 min，提高了竹筍膳食纖維中SDF含量(22.7 g/100 g)，發現纖維素酶能夠增加功能基團的暴露，從而提高陽離子交換能力、葡萄糖和膽固醇吸附能力。Liu等[6]將5%的纖維素酶與經過預水洗結合α-淀粉酶、堿性酶處理后的米糠膳食纖維混合，以料液比1∶15加入乙酸和乙酸鈉混合液，在沸水中水浴30min得到纖維素酶改性米糠膳食纖維，發現經改性后DF的保水性、保油性、膨脹性、膽固醇和葡萄糖吸附能力有所提高，并降低了其乳化能力和葡萄糖透析延遲指數。郭天時等[7]通過木聚糖酶結合微粉作用對脫脂米糠膳食纖維改性大幅提高了SDF得率，同時提高了持水力、持油力。汪楠等[8]發現相較于纖維素酶、高溫蒸煮單一改性，通過高溫蒸煮協同纖維素酶改性竹筍膳食纖維，其粒徑最小，持水力、持油力、膨脹力最大，熱穩定性最強。

DF是谷物中最典型的功能性物質，目前研究主要集中在小麥、稻谷、燕麥和玉米等谷物的加工副產物上，對小米糠DF改性及改性后的理化、功能性質的研究較少。高溫處理能夠顯著提高SDF得率，有效改善膳食纖維的理化和功能性質，關于高溫改性小米糠膳食纖維鮮有研究。前期預實驗分析對比了纖維素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶改性后SDF的得率，結果發現纖維素酶和木聚糖酶復合改性后SDF得率最高。本研究通過高溫-復合酶法改性，提高SDF得率并分析其結構和功能特性，以期為小米的綜合利用及小米糠可溶性膳食纖維的制備和功能性食品的開發提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

小米糠；木聚糖酶(5 000 U/g)、纖維素酶(10 000 U/g)、耐高溫α-淀粉酶(40 000 U/g)、糖化酶(100 000 U/g)和中性蛋白酶(200 000 U/g)；氫氧化鈉、鹽酸、膽固醇、鄰苯二甲醛、正己烷、濃硫酸、冰乙酸等，均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

SE750高速粉碎機，V-5100可見分光光度計，FD-1A-50真空冷凍干燥機RE-2000A型旋轉蒸發器，TDL-5-A型低速臺式大容量離心機，SZF-06A型脂肪測定儀。

1.2 方法

1.2.1 小米糠總DF制備

參考Zheng等[9]和Dhital等[10]的方法。小米糠粉碎過60目篩，正己烷回流脫脂。稱取干燥脫脂米糠以料液比1∶10加蒸餾水，調pH至4.5，60 ℃水浴攪拌2 h去除植酸，3 500 r/min離心20 min，去上清液；沉淀按料液比1∶12加蒸餾水糊化(95 ℃，30 min)，加入高溫α-淀粉酶酶解(pH 6.5，95 ℃，30 min)，直至碘液不變藍為止；糖化酶酶解(pH 4.0～4.5，60 ℃，30 min)；中性蛋白酶酶解(pH 7.0～7.8，60 ℃，90 min)，沸水浴10 min滅酶，3 500 r/min離心 20 min，沉淀于60 ℃真空干燥，得到小米糠總膳食纖維(DF)。

1.2.2 小米糠DF的高溫預處理

將小米糠總膳食纖維(DF)和蒸餾水按一定比例放入錐形瓶后，置于立式蒸汽壓力滅菌鍋內進行高溫改性(120 ℃，20 min)。然后旋轉蒸發濃縮，將濃縮液冷凍干燥粉碎，制得高溫改性小米糠膳食纖維(TDF)。

1.2.3 高溫-復合酶法改性小米糠膳食纖維[11,12]

在1.2.2高溫預處理的基礎上進行復合酶法改性。以料液比1∶15加蒸餾水，調節pH值4.5及適宜溫度后加入酶，持續攪拌1.5 h后滅酶，4倍無水乙醇沉淀12 h，3 500 r/min離心得沉淀，真空冷凍干燥并研磨制得高溫-復合酶改性膳食纖維(T-EDF)。以小米糠SDF得率為指標，分別考察高溫-復合酶法的改性條件。

SDF得率=SD質量/原料質量×100%。

1.2.4 高溫-復合酶法改性小米糠膳食纖維的響應面優化實驗

采用Box-Behnken實驗原理，取復合酶比例、復合酶添加量、酶解時間和酶解溫度4個因素為自變量，以SDF得率為響應值，進行四因素三水平的Box-Behnken實驗，見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

1.2.5 改性前后小米糠膳食纖維的結構檢測與分析

1.2.5.1 色度分析

參照參考文獻[13]。記錄L*值、a*值及 b*值，L*值代表亮度及暗度，a*值表示紅度(+)及綠度(-)，而 b*值代表藍度(-)及黃度(+)。

1.2.5.2 膳食纖維微觀結構表征

取適量小米糠、DF、TDF及T-EDF樣品置于玻璃片，在放大倍數200、1 000及2 000倍的條件下，通過掃描電鏡觀察樣品的表觀結構。

1.2.5.3 纖維樣品分子結構測定

參照李雁等[14]的方法。分別取適量小米糠、DF、TDF及T-EDF與KBr按1∶100的比例混合并研磨均勻，然后在7 MPa的條件下壓制成薄片。

1.2.5.4 纖維樣品結晶度測定

取適量小米糠及幾種膳食纖維粉末置于樣品架，用PW-1710型 X射線衍射儀進行掃描分析，觀察樣品出峰位置和形狀，用Origin 7.5軟件計算其結晶度。

1.2.6 改性前后小米糠膳食纖維的功能特性研究

1.2.6.1 葡萄糖吸附能力測定

參照劉歡等[15]的方法并做修改。

1.2.6.2 膽固醇吸附性的測定

分別稱取0.5 g小米糠、DF、TDF、T-EDF于50 mL燒杯中，加入25 mL攪打均勻的蛋黃乳液，調pH至2和7，于37 ℃水域搖床振蕩2 h。4 000 r/min離心10 min。取上清液1 mL，顯色反應后在波長570 nm處測定其吸光度。

1.2.6.3 陽離子交換能力

分別稱取0.5 g小米糠、DF、TDF、T-EDF于燒杯中，加入50 mL 0.1 mol/L HCl于4 ℃放置過夜，3 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌數次除去Cl-，將殘渣冷凍干燥。稱取0.25 g經處理的樣品加入100 mL 15% NaCl溶液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定(酚酞作指示劑)，振搖5 min仍不褪色為滴定終點，不加樣品的做空白。

1.2.6.4 α-淀粉酶抑制能力測定

參照呂靜[16]的方法并做修改。

1.2.7 數據統計

采用Origin 2018、SPSS12.00軟件進行單因素差異分析，以P<0.05為差異具有統計學意義，響應面實驗用DesignExpert.V8.0.6.1軟件作圖及分析數據。實驗結果用均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 小米糠及總DF基本營養成分分析

由表2可知，小米糠含有豐富的營養物質，以DF為主。DF經酶制備后，膳食纖維純度增加了36.55%，相比黃冬云等[12]經脫脂處理的膳食纖維純度增加了9.82%。小米糠和DF中各營養成分含量均存在顯著性差異(P<0.01)，其中，蛋白質、淀粉去除率達到86.35%、94.83%，說明DF制備過程中雜質去除較為徹底。

表2 小米糠和 DF 中主要營養成分含量(g/100 g)

2.2 高溫-復合酶法改性小米糠膳食纖維的單因素實驗

圖1是高溫-復合酶法改性小米糠膳食纖維的單因素實驗結果。當木聚糖酶是纖維素酶的1.5倍時，SDF得率達到最大，是因為木聚糖酶將不溶性的半纖維素降解為可溶性的，因此SDF得率升高；但當木聚糖酶大于纖維素酶的1.5倍時，SDF得率下降，可能是半纖維素降解的速度超過了其生成速度[17]。因此纖維素酶與木聚糖酶的比例為1∶1.5時為最佳。

圖1 T-EDF的單因素實驗結果

復合酶用量在1%～2%的過程中，SDF得率顯著增大，且在2%處達到最大。這可能是由于復合酶促進纖維素水解生成了單糖、可溶性多糖等物質[18]。當復合酶用量高于2%，SDF繼續降解為小分子物質，得率隨之下降。選擇復合酶用量為2%。

隨反應時間增加，SDF得率先增后降，當反應時間在1.5 h時SDF得率達到最大值，可能是因為適當的酶解時間可促進纖維素將不溶性大分子水解為可溶性小分子物質；而隨酶解時間的延長，SDF繼續降解但醇沉卻不能析出，因此SDF得率下降[19]。酶解時間選擇1.5 h為最佳。

此外，隨酶解溫度的升高，SDF得率亦呈先增后降的趨勢。從40～50 ℃的過程中，SDF得率升高和溫度與酶活性相關，溫度太低導致酶活性受抑制；在50 ℃時，酶活性最強，反應速度最快，SDF得率最高；但超過50 ℃后，酶變性甚至失活，SDF得率下降。選擇酶解溫度50 ℃為最適。

2.3 高溫-復合酶改性小米糠膳食纖維的響應面優化實驗

2.3.1 響應面優化實驗結果

高溫-復合酶法改性小米糠膳食纖維的響應面優化實驗結果如表3所示，并利用Design-Expert 8.0.6軟件分析二次回歸參數模型，結果如表4所示。

表3 Box-Behnken實驗設計方案及結果

由表3可見，整體模型P<0.000 1，二次方程模型極顯著，且失擬項P為0.288 7不顯著，說明回歸模型擬合度較好，實驗誤差小。R2為0.948 2，大于90%，相關性較好，說明此模型能夠反映響應值的變化，可用該模型對小米糠膳食纖維高溫-復合酶法改性的結果進行分析和預測[20]。由表4可得各因素與響應值關系的四元二次回歸方程為：

表4 回歸模型系數的顯著性檢驗

Y=75.19+0.92X1+0.1X2+9.43X3+0.40X4+0.16X1X2+0.036X1X3+0.24X1X4+0.053X2X3+0.15X2X4+0.23X3X4-27.14X12-17.40X22-34.03X32-19.26X42。說明影響SDF得率大小的順序為酶解時間>復合酶比例>酶解溫度>復合酶用量。

2.3.2 各因素兩兩交互作用對 SDF得率的影響

任意因素固定不變(0水平)的條件下，比較各因素兩兩交互對SDF得率的影響，結果如圖2所示。各因素交互作用的等高線呈橢圓形，說明交互作用顯著。通過軟件對模型分析確定最佳工藝條件為：復合酶比例1.82∶1，復合酶質量分數1.99%，酶解溫度 49.93 ℃，酶解時間1.60 h，預測SDF得率為17.39%。為了驗證響應面模型的可靠性，同時考慮實際操作，選擇最佳工藝參數為復合酶比例2∶1，復合酶用量2%，酶解溫度 50 ℃，酶解時間1.50 h，并在此工藝參數下重復3次驗證實驗，得到SDF的實際得率為(17.27±1.57)%，與理論值接近且重復性較好，說明此回歸模型具有可靠性和有效性。

圖2 各因素交互作用對SDF得率影響的響應面圖

2.4 改性前后膳食纖維色度測定

如表5所示，脫脂小米糠改性后，L*值均有下降。然而，纖維樣品的a*值及b*值則因改性方式不同而有不同程度的增加，色度測定表明膳食纖維經過兩種改性后均可輕微提高樣品顏色。膳食纖維顏色發生改變的原因可能是粒徑、表面粗糙程度、內容物的變化等，但是改性前后膳食纖維粉末均為微黃色。

表5 脫脂小米糠、DF、TDF及T-EDF的色度

2.5 改性前后小米糠的微觀結構分析

掃描電鏡可觀測電子束照射到樣品表面的凹凸情況，從而分析改性后膳食纖維的結構特性，確定其表面形態。圖3為脫脂小米糠和膳食纖維的微觀結構圖，可以看出4種樣品顆粒表面形態發生顯著變化。脫脂小米糠呈現出不規則、表面光滑無孔洞的片狀結構，表面附著大量球狀和塊狀物質，可能是分離純化后殘留的蛋白質聚合物及小淀粉顆粒[21]。DF呈現出規律、緊湊的片狀結構，表面光滑規整，內部則是中空的多孔網狀結構分布。經過高溫α-淀粉酶和蛋白酶處理，樣品表面只殘存很少的圓球狀顆粒，說明雜質去除較為徹底。TDF的纖維表面明顯光滑，內部呈網狀結構。而T-EDF表面粗糙，帚化微纖維增加[22]，復合酶的作用使纖維表面水解，促進了扁平帶狀結構的破裂和脫離。使得膳食纖維結構表現出更疏松的狀態，形成更強的毛細管吸附作用，從而改善膳食纖維的功能特性[23]。

圖3 脫脂小米糠及其膳食纖維的掃描電子顯微鏡圖(×2 000)

2.6 改性前后小米糠的紅外光譜分析

如圖4所示，改性前后膳食纖維紅外光譜圖相似，但是部分吸收峰有所變化。膳食纖維的紅外光譜圖(4 000～500 cm-1)中均包含了烴基、吡喃糖環所含乙醇基的C—O伸縮振動，吡喃糖環狀結構的特征鍵C—O—C的不對稱收縮振動，脂肪族類C—H對稱和非對稱伸縮振動，C—H不對稱和對稱彎曲，C—C伸縮振動等一系列典型多聚糖的吸收峰[14]。在3 400～3 300 cm-1處的強吸收峰是O—H基團，其主要源自果膠和纖維素，此外，T-EDF在3 423 cm-1處的峰遷移至3 404.3 cm-1處，吸收峰遷移和強度增強的原因可能是高溫-復合酶處理后纖維素分子結構被破壞，去除了多數的木質素[24]，部分糖苷鍵斷裂形成氫鍵。改性前后的4種樣品在2 924 cm-1和1 742 cm-1處有弱吸收峰，均有C—H的反對稱拉伸和彎曲振動引起，主要來源于部分多糖的亞甲基和羰基。綜上，經過改性后的膳食纖維的吸收峰無明顯變化，說明無基本化學結構被破壞。吸收峰強度的差異是由于含量或結合程度不同，同時說明高溫-復合酶法能有效去除原纖維中無定形組分。

圖4 脫脂小米糠及其膳食纖維的紅外光譜圖

2.7 改性膳食纖維的X-RD分析

圖5為脫脂小米糠及其改性膳食纖維的XRD圖。脫脂小米糠在掃描角度2θ為22.86°處有明顯的結晶衍射峰，同時在15.16°處有較弱的衍射峰，這些峰均表明脫脂小米糠具有典型的纖維素Ⅰ型的X射線衍射曲線特征[25]，為結晶區與非結晶區兩相共存的狀態。DF、TDF以及T-EDF的XRD圖譜形狀相似，表明其結晶特征變化不大，其主衍射峰分別在2θ為21.88°、21.62°和22°處，且在34.5°附近具有微弱的衍射峰，說明三者的晶體類型均為纖維素I型，為結晶區與非結晶區兩相共存的狀態[26]；另外，根據軟件曲線法擬合計算出脫脂小米糠、DF、TDF和T-EDF的結晶度分別為33.76%、35.01%、37.78%和55.56%，即改性后樣品的結晶度均高于小米糠，可能與小米糠中蛋白質殘基的去除有關，同時表明無定形區的纖維素更易遭到破壞。T-EDF結晶度較高，推測是復合酶作用于DF中的半纖維素以及纖維素中的無定形區所致[27]。

圖5 脫脂小米糠及膳食纖維XRD圖譜

2.8 改性膳食纖維的功能性質

由圖6a可知，經過酶法提取后的DF較脫脂小米糠葡萄糖吸附能力顯著提高(P<0.05)，而經高溫-復合酶改性處理后吸附能力略有提高。改性處理使膳食纖維表面孔隙增大，結構更疏松，功能基團暴露，葡萄糖吸附能力隨之增大[28]。所有經過預處理的膳食纖維都能吸附少量的葡萄糖，這就表明小米糠膳食纖維能夠在一定程度上降低小腸中的葡萄糖濃度。

由圖6b可知，膽固醇的吸附能力在中性條件(模擬小腸環境)明顯強于酸性環境(模擬胃的pH環境)，這與多數研究結果一致，可能是大量的H+與膽固醇攜帶的部分正電荷產生相互排斥的作用，導致吸附能力有所下降[29,30]。改性后膳食纖維的膽固醇吸附能力均大于改性前的吸附能力，在pH=2時，T-EDF的膽固醇吸附性較強，分別是脫脂小米糠、DF、的1.29、1.15倍，但沒有TDF的吸附性高，可能是由于酸性條件下高溫使得膳食纖維內部基團暴露更易于膽固醇結合；在pH=7時，T-EDF的膽固醇吸附性最強，分別是脫脂小米糠、DF、TDF的1.55、1.36、1.22倍。

膳食纖維分子結構中存在大量羧基和羥基的側鏈基團，能夠與陽離子可逆交換。由圖6c可觀察到，陽離子交換能力大小依次為：T-EDF>TDF>DF>脫脂小米糠，說明改性處理可以提高陽離子交換能力，這可能是由于改性處理使膳食纖維粒徑減小，表面更光滑，從而表面糖醛酸結合位點暴露，更易于陽離子交換。這與傅里葉紅外光譜測定結果一致[31]。

由圖6d可知，對照組葡萄糖生成含量相比(1.1 mg/g)，4種樣品的添加均使葡萄糖含量降低，表明4種樣品對α-淀粉酶均有一定的抑制作用。脫脂小米糠對α-淀粉酶的抑制率較其他3種樣品最低，是因為膳食纖維可以包埋淀粉和淀粉酶從而限制淀粉與淀粉酶之間的相互作用，甚至膳食纖維表面可能附著抑制劑，從而可以直接抑制酶的活性[32]。

圖6 脫脂小米糠及膳食纖維功能特性

3 結論

通過Box-Behnken實驗設計，結合響應面分析及實際操作，最終確定高溫-復合酶法改性脫脂小米糠膳食纖維的最優工藝條件為復合酶比例2∶1、復合酶2%、時間1.50 h及溫度50 ℃。在此條件下，SDF得率達到(17.27±1.57)%，比高溫改性小米糠SDF提高了6.48%。

通過紅外光譜和X射線衍射分析結果顯示，改性前后膳食纖維的結構具有明顯的糖類特征吸收峰，且改性前后的特征吸收峰的峰形、位置無明顯變化；改性后XRD圖譜相似，晶體類型不變，均為纖維素Ⅰ型，但是結晶度上升，表明改性后膳食纖維表面結構被破壞，使纖維素結晶區暴露。此外，脫脂小米糠改性后其葡萄糖、膽固醇吸附能力及陽離子交換能力顯著增強。