甘草堿溶性多糖超聲提取工藝的均勻設計法優選

唐世明

（和田師范專科學校,新疆 和田 848000）

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）為豆科甘草屬多年生草本植物，味甜，能夠清熱解毒，極具藥用價值[1]。尤其是甘草堿溶性多糖具有提高免疫力、抗病毒等功效，是甘草資源開發和利用的重點。

研究表明，超聲提取法具有流程簡單、節約成本的優點[2-3]，而當前使用均勻設計法優選甘草堿溶性多糖提取工藝的報道較少。本文以甘草堿溶性多糖提取率為指標，分析NaOH濃度、料液比、提取時間、提取溫度等對多糖提取率的影響，通過U*6（64）均勻設計試驗優化超聲法的提取工藝條件，為甘草的開發利用提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 試材和試劑

甘草購買于和田市欣明維吾爾醫藥材交易市場，烘干粉碎。

試驗試劑包括石油醚（A.R）、無水乙醇（A.R）、正丁醇（A.R）、三氯甲烷（A.R）、丙酮（A.R）、濃硫酸（A.R）、苯酚（A.R）、NaOH（A.R）、葡萄糖（A.R）。

1.2 儀器與設備

可見分光光度計722S（上海精密科學儀器有限公司制造），臺式離心機TDL-40B9（上海安亭科學儀器廠制造），數顯恒溫水浴鍋HH-Z（國華電器有限公司），RE-6000A型旋轉蒸發儀（上海亞榮儀器設備有限公司），超聲波清洗儀KQ-250DB（昆山市超聲波儀器有限責任公司）。

2 試驗方法

2.1 超聲提取法

對甘草進行清洗、烘干、粉碎處理。稱取30 g甘草粉末置于圓底燒瓶中，加入180 mL石油醚，放入60～90 ℃水浴鍋中脫脂2 h。舍棄脫脂液，用180 mL80%乙醇浸泡殘渣3 h，之后80 ℃水浴加熱1 h，過濾。稱取脫脂后甘草粉末若干份（0.5g/份），分別在選定的NaOH濃度、料液比、提取時間、提取溫度、250W的超聲功率下使用超聲波儀器進行超聲，提取一次，將提取液2 000 rpm離心5 min，取上清，加入0.1%活性炭，60 ℃水浴鍋脫色20 min，再2 000 rpm離心5 min。取上清，加入1.5倍體積的氯仿-正丁醇搖勻，靜置25 min后吸取上清液，加入95%乙醇靜置12 h，然后2 000 rpm離心5 min。去上清，沉淀依次用無水乙醇、丙酮多次洗滌，60 ℃干燥至恒重。

2.2 標準曲線的制備

精確量取葡萄糖標準溶液0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL、2.1 mL置于標有A、B、C、D、E、F、G、H號的干燥試管中并分別加水至3.0 mL，再分別加入6%苯酚溶液0.8 mL及濃硫酸4.8 mL，靜置10 min，充分搖勻，室溫下再放置20 min。同時以蒸餾水作為空白對照，在490 nm處測定每個試管中溶液的吸光度A值。以濃度（c）為橫坐標（X），吸光度A值為縱坐標（Y），繪制標準曲線[4]，得到A=0.012 2c-0.067 3，R2=0.997。

2.3 甘草堿溶性多糖含量的測定

精確量取1 mg甘草堿溶性多糖粉末于50 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻；精確量取1 mL此稀釋液于10 mL的容量瓶中，加水至刻度線定容，搖勻。最終將提取液稀釋500倍。精確量取2 mL稀釋后的溶液于試管中，滴加6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，充分搖勻，室溫下再靜置20 min后在490 nm處測定吸光度A值。利用回歸方程求甘草堿溶性多糖含量。

2.4 單因素試驗設計

控制單一變量分別研究NaOH濃度（20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、提取時間（15 min、20 min、25 min、30 min）、提取溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）四個因素對甘草堿溶性多糖提取率的影響（見表1）。

2.5 均勻設計試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇U*6（64）均勻設計試驗表研究Na0H濃度、料液比、提取時間、提取溫度四個因素的相互影響，各因素水平情況和均勻設計試驗方案見表2。

表2 U*6（64）設計方案

3 結果

單因素試驗中，按照表1中各因素水平，在料液比為1:20（vol），45℃下超聲提取25min，測得NaOH濃度為40mg/mL時甘草堿溶性多糖的提取率最高。在 NaOH溶液為40 mg/mL，45℃下超聲提取25min，測得甘草堿溶性多糖的提取率在料液比為達到1 ∶20（vol）時最高。在料液比為1:20（vol），NaOH溶液為40 mg/mL，45℃下超聲提取，測得甘草堿溶性多糖的提取率在提取時間為25min時最高。在料液比為1 ∶20（vol），NaOH溶液為40 mg/mL下超聲提取25min，測得甘草堿溶性多糖的提取率在提取溫度為45℃時最高。因此甘草堿溶性多糖的最佳提取條件為：NaOH濃度為40mg/mL，料液比達到1:20（vol），提取時間為25min，提取溫度為45℃。

表1 單因素試驗設計各因素水平

按照U*6（64）使用表（如表2）進行試驗，其結果見表3。其中以第3號試驗所得提取率最高，為48.45%。

表3 U★6（64）試驗表及結果

即當Na0H濃度取3號因素水平22.5 mg/mL，料液比取6號因素水平1 ∶35，提取時間為2號因素水平25 min，

提取溫度為4號因素水平45 ℃時，四種因素相互作用對多糖提取率影響最大。求得回歸方程為Y=87.04-0.24X1-903.00X2-0.16X4，回歸方程、偏回歸系數經檢驗均不顯著，說明回歸方程不可信。

考慮四個因素的二階以及所有的交互作用重新設計，選用U*17（178）使用表（見表4）進行試驗，其結果過見表5。其中以第6號試驗所得多糖提取率最高，即當Na0H濃度取6號因素水平30 mg/mL，料液比取9號因素水平1 ∶25，提取時間為16號因素水平45 min，提取溫度為5號因素水平30℃時，四種因素相互作用對多糖提取率影響最大。用線性回歸模型擬合數據，求得回歸方程為Y=70.72-896.13X2，回歸方程、偏回歸系數經檢驗顯著，說明回歸方程可信。因此，其工藝條件為Na0H濃度為30 mg/mL，料液比為1 ∶25，提取時間為45 min，提取溫度為30℃。

表4 U*17（178）各因素水平

表5 U*17（178）試驗表及結果

4 討論與結論

通過單因素試驗確定了甘草堿溶性多糖的最佳提取條件為：NaOH濃度為40mg/mL，料液比達到1 ∶20（vol），提取時間為25min，提取溫度為45℃。在單因素試驗的基礎上，采用U*6（64）均勻設計法對四個提取條件進一步篩選，其最佳工藝條件為Na0H濃度為22.5 mg/mL，料液比為1 ∶35，提取時間為25 min，提取溫度為45 ℃，用線性回歸模型擬合數據，求得回歸方程為Y=87.04-0.24X1-903.00X2-0.16X4，回歸方程、偏回歸系數經檢驗均不顯著，說明回歸方程不可信。重新采用U*17（178）均勻設計法對四個提取條件重新篩選，其最佳工藝條件為Na0H濃度為30mg/mL，料液比為1 ∶25，提取時間為45 min，提取溫度為30℃。獲得線性回歸方程Y=70.72-896.13X2，經統計檢驗方程顯著。因此，最終通過均勻設計法優化草堿溶性多糖的最佳提取條件為Na0H濃度為30 mg/mL，料液比為1 ∶25，提取時間為45 min，提取溫度為30℃。同時也說明回歸方程并非真正的最終模型，而是在線性框架下的產物。