外泌體促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的meta分析

蘇 歡，簡華剛

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診外科 400010)

隨著人類生存壽命延長，慢性疾病的研究得到更多的關(guān)注，比如糖尿病及其并發(fā)癥，10%～15%糖尿病患者承受著糖尿病潰瘍引起的生理和心理壓力[1]。健康皮膚的完整性對維持人體生理穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[2]。干細(xì)胞因自我更新能力在創(chuàng)面修復(fù)方面擁有獨特優(yōu)勢，能調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境[3]，促進(jìn)血管化的肉芽組織基質(zhì)形成，抑制傷口愈合細(xì)胞凋亡[4]。越來越多研究證明干細(xì)胞是通過旁分泌機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用[5-6]。外泌體富含來源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、受體、核酸等，與細(xì)胞具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可轉(zhuǎn)運(yùn)功能性miRNA至靶細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞間通訊[7]，還可以激活傷口愈合過程中的重要信號級聯(lián)通路[8]，增強(qiáng)細(xì)胞因子、生長因子等相關(guān)基因表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性因子表達(dá)，改善細(xì)胞衰老，增強(qiáng)傷口愈合相關(guān)細(xì)胞增殖遷移[9-10]，在各個階段均能發(fā)揮優(yōu)勢[11]。

本文旨在研究外泌體對糖尿病潰瘍愈合的有效性，但目前相關(guān)研究主要處于動物實驗階段，暫無臨床試驗，故納入外泌體應(yīng)用于動物模型糖尿病潰瘍的隨機(jī)對照試驗(RCTs)進(jìn)行meta分析，擬為臨床治療糖尿病潰瘍提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入所有關(guān)于外泌體促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的 RCTs，語種不限。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)皮膚創(chuàng)面；(2)動物實驗，種屬、性別及年齡不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)干預(yù)措施不符合；(2)非隨機(jī)對照試驗；(3)重復(fù)發(fā)表；(4)原始數(shù)據(jù)不足，無法納入評價的文獻(xiàn)；(5)可提取數(shù)據(jù)不足以統(tǒng)計；(6)非皮膚創(chuàng)面。

1.2 干預(yù)措施及結(jié)局指標(biāo)

實驗組采取外泌體應(yīng)用于糖尿病動物模型，過程中干預(yù)方式、治療時間、劑量、載體、創(chuàng)面大小、注射間距等不限。對照組采取PBS緩沖液或生理鹽水或空白對照等。結(jié)局指標(biāo)：(1)創(chuàng)面愈合率；(2)新生血管密度；(3)膠原纖維沉積百分比；(4)再上皮化情況；(5)創(chuàng)面瘢痕情況。

1.3 檢索策略

檢索PubMed、EMbase、The Cochrane Library、知網(wǎng)、CBM、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫，檢索時間為建庫至2021年2月。

以主題詞、自由詞結(jié)合進(jìn)行檢索；英文檢索詞包括：“exosomes”and“diabetic” or“diabetes”and“foot”or“feet”or “ulcer”or“wound”；中文檢索詞包括“外泌體”“糖尿病潰瘍”“糖尿病傷口”“糖尿病創(chuàng)面”“糖尿病足”“足潰瘍”“糖尿病壞疽”。

1.4 檢索文獻(xiàn)的篩選和資料提取

兩名評價者按照既定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索、篩選、數(shù)據(jù)提取，如遇分歧由第三方評定。提取的資料包括：納入研究的標(biāo)題、發(fā)表時間、第一作者、樣本量、干預(yù)措施、研究動物模型及初始創(chuàng)面、結(jié)局指標(biāo)。

1.5 文獻(xiàn)質(zhì)量評價

納入研究的質(zhì)量采用 Cochrane 手冊針對 RCTs 的偏倚風(fēng)險進(jìn)行評估。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用系統(tǒng)評價軟件Rev Man 5.3進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(SMD)及 95%可信區(qū)間(95%CI)為效應(yīng)指標(biāo)，根據(jù)異質(zhì)性結(jié)果選擇隨機(jī)效應(yīng)模型或固定效應(yīng)模型，如Q檢驗和I2檢驗提示各研究間存在較大的異質(zhì)性，采用亞組分析探討異質(zhì)性來源。漏斗圖用于檢測發(fā)表偏倚。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

共檢索出253篇相關(guān)文獻(xiàn)，其中中文 46 篇，英文 207篇，剔除重復(fù)文獻(xiàn)后共140篇，初步閱讀題目和摘要剩余 49篇，閱讀全文最終納入10篇文獻(xiàn)[12-21]。其中中文3篇，英文7篇，總樣本量207只，文獻(xiàn)檢索流程見圖1。納入文獻(xiàn)基本特征見表1，偏倚風(fēng)險評價見表2。

表1 納入研究的基本特征

表2 納入研究的偏倚風(fēng)險評價

圖1 文獻(xiàn)檢索流程

2.2 結(jié)果分析

2.2.1創(chuàng)面愈合率

6項研究[12-17]報道了第7天創(chuàng)面愈合率的情況，各研究間具有異質(zhì)性(P<0.10,I2>50%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型。meta 分析結(jié)果顯示：實驗組在實驗進(jìn)程的第 7 天創(chuàng)面愈合得更快(SMD=8.33,95%CI:5.58～11.09，P<0.001)，見圖2。

圖2 實驗組與對照組第7天創(chuàng)面愈合率的meta分析

5項研究[12-14,17-18]報道了第14天創(chuàng)面愈合率的情況，各研究間具有異質(zhì)性(P<0.10,I2>50%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型。meta 分析結(jié)果顯示：實驗組在第14天創(chuàng)面愈合得更快(SMD=3.97,95%CI：2.44～5.49，P<0.001),見圖3。

圖3 實驗組與對照組第14天創(chuàng)面愈合率的meta分析

2.2.2創(chuàng)面組織情況

5項研究[13-14,16-17,19]報道了2周后創(chuàng)面新生血管的情況，各研究間具有同質(zhì)性(P>0.10,I2<50%)，采用固定效應(yīng)模型。meta分析結(jié)果顯示：實驗組創(chuàng)傷部位新生血管密度比對照組高(SMD=7.60,95%CI：4.96～10.24，P<0.001),見圖4。

圖4 實驗組與對照組2周后新生血管數(shù)的meta分析

3項研究[13-14,16]報道了第14天膠原纖維沉積的情況，各研究間具有異質(zhì)性(P<0.10,I2>50%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型。meta 分析結(jié)果顯示：實驗組創(chuàng)面膠原纖維沉積百分比高于對照組(SMD=6.98，95%CI:1.41～12.56，P=0.010),見圖5。

圖5 實驗組與對照組第 14 天創(chuàng)面膠原纖維沉積百分比的meta分析

4項研究[13-14,17,20]報道了再上皮化的情況，各研究間具有異質(zhì)性(P<0.10,I2>50%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型。meta 分析結(jié)果顯示：實驗組創(chuàng)面愈合過程中再上皮化程度高于對照組(SMD=16.81，95%CI：1.81～31.80，P=0.030),見圖6。

圖6 實驗組與對照組創(chuàng)面再上皮化情況的meta分析

2項研究[17,21]報道了瘢痕形成的情況,各研究間具有同質(zhì)性(P>0.10,I2<50%)，采用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果顯示：實驗組創(chuàng)面愈合過程中瘢痕形成低于對照組(SMD=-3.41,95%CI：-5.21～-1.60，P<0.001),見圖7。

圖7 實驗組與對照組創(chuàng)面瘢痕情況的meta分析

2.3 發(fā)表偏倚

以第7 天創(chuàng)面愈合率為指標(biāo)進(jìn)行發(fā)表偏倚的分析，結(jié)果顯示呈非對稱性分布，表明納入研究存在潛在發(fā)表偏倚，見圖8。

圖8 納入文獻(xiàn)的漏斗圖分析

2.4 亞組分析

meta分析顯示各研究間存在一定異質(zhì)性，考慮納入研究間外泌體來源及干預(yù)方式存在差異，以創(chuàng)面愈合率為指標(biāo)進(jìn)行亞組分析進(jìn)一步探索異質(zhì)性來源。

以第14天創(chuàng)面愈合率為指標(biāo)的亞組分析顯示內(nèi)皮組細(xì)胞外泌體(組1)無明顯異質(zhì)性(I2=0，P=0.48)，脂肪干細(xì)胞外泌體(組2)無明顯異質(zhì)性(I2=0，P=0.32)，合并后亞組存在異質(zhì)性(I2=99%，P<0.01)。第7天創(chuàng)面愈合率的亞組分析顯示組1、組2研究無明顯異質(zhì)性(I2=50%，P=0.16;I2=0，P=0.89)，牙齦和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體組間存在異質(zhì)性(I2=86%，P<0.01)，合并后各亞組間存在異質(zhì)性(I2=70%，P=0.04)。

第7天創(chuàng)面愈合率指標(biāo)中，局部注射外泌體組有異質(zhì)性(I2=79%，P<0.01)，外泌體覆蓋創(chuàng)面組無明顯異質(zhì)性(I2=0，P=0.34)，合并后異質(zhì)性無明顯升高(I2=74%，P<0.01)。第14天創(chuàng)面愈合率同理分析，局部注射外泌體組無異質(zhì)性(I2=0，P=0.86)，外泌體覆蓋創(chuàng)面組有異質(zhì)性(I2=58%，P=0.09)，合并進(jìn)行亞組差異性檢驗顯示有異質(zhì)性(I2=63.2%，P=0.10)。

3 討 論

外泌體生物發(fā)生是一種蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機(jī)制，從質(zhì)膜和核內(nèi)體膜出芽產(chǎn)生并釋放，參與包括發(fā)育、免疫、退行性疾病等相關(guān)通路，正被開發(fā)為多種疾病模型的診療手段[22-23]。本文主要探討外泌體在皮膚創(chuàng)面愈合方面的作用。大多數(shù)情況創(chuàng)面能正常愈合，但合并某些易感因素時未經(jīng)過有序、及時的修復(fù)而形成慢性創(chuàng)面[3]，促炎因子、蛋白酶、活性氧及衰老細(xì)胞水平升高。目前糖尿病創(chuàng)面治療效果不盡人意，嚴(yán)重降低生活質(zhì)量[5]。研究證明外泌體是一種理想的治療手段，擁有與干細(xì)胞相同或更強(qiáng)的組織修復(fù)效果。

本meta分析結(jié)果顯示：與對照組相比，實驗組應(yīng)用外泌體后，糖尿病潰瘍創(chuàng)面在第 7、 14 天均表現(xiàn)出更高的創(chuàng)面愈合率，并且在創(chuàng)傷部位新生血管密度增高，說明外泌體可以促進(jìn)血管形成，改善局部組織血流及氧供，從而促進(jìn)糖尿病潰瘍?nèi)庋拷M織生長，加速創(chuàng)面修復(fù)；在促進(jìn)上皮新生、增加膠原纖維沉積方面，外泌體被證明是有效的；同時，本meta分析表明了外泌體在減少瘢痕形成方面也有一定作用。與對照組相比，外泌體治療可增加第11、21天糖尿病潰瘍愈合率(SMD=28.52,95%CI：11.54～45.50，P=0.001；SMD=27.35,95%CI：19.91～34.79，P<0.001)，但因描述上述兩個指標(biāo)的研究僅有兩篇，故未將森林圖列出。

楊榮華等[15]證明，外泌體實驗組的創(chuàng)面組織促炎因子 TNF-α、IL-1β 表達(dá)減少，抗炎因子 IL-10 表達(dá)較高；外泌體處理的創(chuàng)面?zhèn)笱苊芏仍黾覽20,24]，神經(jīng)纖維密度增加[24]，提示外泌體可能促進(jìn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的再生；SHI等[14]同樣也證明外泌體可促進(jìn)血管生成和神經(jīng)元生長，進(jìn)而優(yōu)化糖尿病潰瘍愈合進(jìn)程。但當(dāng)前研究描述炎性因子、神經(jīng)纖維的文獻(xiàn)數(shù)目較少，且原始數(shù)據(jù)文獻(xiàn)中未列出，故未納入結(jié)局指標(biāo)。

meta分析顯示各研究間存在一定異質(zhì)性，故進(jìn)行亞組分析進(jìn)一步探索異質(zhì)性來源。亞組分析結(jié)果顯示外泌體可以提高創(chuàng)面愈合率，異質(zhì)性可能來源于外泌體種類差異。不同類別細(xì)胞組及合并各亞組后異質(zhì)性升高，外泌體種類差異有很大可能為異質(zhì)性來源。以干預(yù)方式進(jìn)行亞組分析的異質(zhì)性結(jié)果不具有穩(wěn)定性，干預(yù)方式不一定是異質(zhì)性的來源。

本系統(tǒng)評價及外泌體應(yīng)用存在一定局限性：(1)納入文獻(xiàn)數(shù)據(jù)較少；(2)納入研究樣本量較小；(3)研究選擇外泌體的種屬、劑量、干預(yù)方式等不一致，且各研究測量和統(tǒng)計方法存在差別，可能是此meta分析異質(zhì)性的來源；亞組分析提示外泌體種類可能是異質(zhì)性來源，但仍不能排除及明確其他異質(zhì)性來源，需要更大的樣本量來證實；(4)部分納入研究質(zhì)量不高，未對序列產(chǎn)生、分配隱藏進(jìn)行描述，可能存在選擇偏倚；未對研究者、評價者是否采用盲法進(jìn)行描述，可能存在實施偏倚；(5)外泌體實驗?zāi)Ｐ蜑樘悄虿∈?，得出的實驗結(jié)論因物種的差別是否適合應(yīng)用于臨床需謹(jǐn)慎看待。

綜上所述，本系統(tǒng)評價結(jié)果表明外泌體可以促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合，提高創(chuàng)面愈合率，改善局部血供及肉芽組織生長。但由于樣本量少，納入文獻(xiàn)質(zhì)量不高，可能影響評價的結(jié)果；關(guān)于使用外泌體的種類、劑量、給藥途徑等標(biāo)準(zhǔn)化流程及如何應(yīng)用于臨床試驗值得進(jìn)一步研究驗證，未來期待更大規(guī)模、多中心、嚴(yán)標(biāo)準(zhǔn)的隨機(jī)對照試驗。