PARP1單核苷酸多態性與轉移性食管鱗癌順鉑化療敏感性及預后關系*

趙 萬，仇俊蘭，許麗華，張 懷，張 允，余玲玲，奉 林

(南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院腫瘤科，江蘇蘇州 215153)

食管癌是第六大常見腫瘤，我國食管癌每年新發病例約占全球的一半[1]。最常見的病理類型是食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，約占總數的90%。食管癌患者在診斷時多數已處于中晚期，無手術根治機會，化療仍是最重要的治療手段。然而，約半數以上食管癌患者對化療并不敏感，化療耐藥已成為晚期食管癌治療的瓶頸。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[Poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]是一種核蛋白，參與多種細胞功能，包括基因轉錄調控、染色質重塑及DNA損傷修復[2]。研究發現，在卵巢癌耐藥細胞中PARP1呈高表達，通過下調PARP1水平，可恢復癌細胞對順鉑(cisplatin，DDP)的敏感性[3]。此外， PARP1是食管癌細胞中miR-223的直接靶基因，PARP1表達減少的細胞顯示對化療更加敏感[4]。PARP1表達水平還被證實是卵巢癌[5]和食管癌[6]患者的臨床預后指標。

PARP1單核苷酸多態性能改變PARP1的轉錄和表達[7]，進而影響食管癌[8]的發病風險。但是，目前其與腫瘤化療療效的關系仍不清楚。因此，本研究旨在評價PARP1基因rs907187C/G、rs8679T/C和rs1136410T/C單核苷酸多態性對接受DDP為基礎化療的轉移性ESCC患者的化療反應及總生存期(overall survival，OS)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年7月至2020年1月本院收治的175例轉移性ESCC患者，其中男97例，女78例，年齡27～79歲，中位年齡58歲，均為漢族。本研究經醫院倫理委員會審批(2016KJCYY017)，受試者均自愿參加研究并簽署知情同意書。納入標準：(1)經組織病理學確診為ESCC；(2)伴有遠處臟器或組織轉移，無法手術根治切除；(3)至少有1個可經CT掃描測量評價的腫瘤病灶；(4)化療前心電圖、血常規、生化電解質均正常；(5)Karnofsky評分≥70分；(6)預計患者生存期超過3個月。排除標準：(1)年齡<18歲；(2)哺乳期或妊娠期婦女；(3)精神病史或存在認知障礙；(4)屬于化療禁忌證；(5)對研究藥物過敏；(6)既往接受過任何形式的抗腫瘤治療。

1.2 方法

1.2.1化療方案及療效評價

所有受試者均接受DDP聯合卡培他濱(capecitabine，CAPE)化療:DDP(齊魯制藥有限公司)75 mg/m2，加入生理鹽水500 mL靜脈滴注，第1天；CAPE (羅氏制藥有限公司)1 000 mg/m2，第1～14天口服，停藥7 d，21 d為1個周期。2個周期治療后行CT掃描測量腫瘤大小變化，依據RECIST1.1實體瘤評價標準，近期療效分為穩定(SD)、進展(PD)、部分緩解(PR)和完全緩解(CR)。PR、CR屬于化療敏感，而SD、PD對化療不敏感。所有受試者至少完成2個周期的化療，在治療過程的任何時間出現PD，則停止當前方案化療，更改為二線治療方案或予最佳支持治療。

1.2.2隨訪

本研究使用電話、電子郵件、查閱電子病歷系統等方式隨訪，截止時間為2020年12月30日。本組患者隨訪3～32個月，Reverse Kaplan-Meier法計算中位隨訪時間為30.3個月(95%CI：26.56～34.04)。其中19例受試者失訪，失訪患者的生存時間按截尾數據處理。OS：從首次化療開始至因任何原因引起死亡的時間(失訪患者為最后一次隨訪時間)。

1.2.3DNA提取和基因型分析

首次化療前抽取靜脈血5 mL，外周血DNA提取采用DNA快速抽提純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，DNA樣本置于-20 ℃冰箱保存。使用TaqMan探針法對基因型進行鑒別，PCR引物及探針由上海索寶生物科技有限公司制備，PCR反應預混液(TaqMan Real-Time PCR Master Mixes)由賽默飛世爾科技公司制備，PCR在美國ABI 7900HT實時熒光定量PCR儀上進行。PCR體系：DNA樣本1.0 μL，3.0 μL Mix、上下游引物各0.5 μL、TaqMan探針各0.5 μL、雙蒸水4.0 μL。PCR循環參數：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個循環，72 ℃延伸8 min。捕獲熒光信號后，經SDS軟件分析得出基因型結果。rs907187：上游引物5′-TCGAATGTGCACTCAGTGATC-3′，下游引物5′-AGTATATGACGCATCGTCTGT-3′，探針：FAM-TACAGTGCTCACGCCATGGACA-MGB，HEX-TACT GCTCTACTAGCTTCGAT-MGB；rs8679：上游引物5′-AGTTAGCTGTCTAATGTGTC-3′，下游引物5′-CTA GTGGAGACTACGACGTC-3′，探針：FAM-TCACGCATCTAGCTAAGTATC-MGB，HEX-TACATCGGCT GATGATCTACAT-MGB；rs1136410：上游引物5′-ATGAGTCGCTTCGACTAGTGTCT-3′，下游引物5′-ATCCTACTCATGCTAACGTACA-3′，探針：FAM-CATGCTACTACATAGATGCTC-MGB，HEX-ATACT GAGTAGCAGTGTTACT-MGB。

1.3 統計學處理

采用SPSS23.0統計軟件進行分析。擬合優度卡方檢驗Hardy-Weinberg平衡。卡方檢驗分析臨床特征與化療反應的關系；logistic回歸分析基因型對化療反應的影響，計算OR及95%CI，并經性別、年齡、分化等因素調整；Kaplan-Meier法繪制生存曲線；基因型與OS的關系分別用Log-rank檢驗和Cox回歸模型進行單因素和多因素分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床特征對化療反應的影響

175例轉移性ESCC患者2例(1.1%)CR，66例(37.7%)PR，51例(29.1%)SD，56例(32.0%)PD，總化療有效率(CR+PR)為38.8%。患者年齡、性別、飲酒史、吸煙史、腫瘤分化程度、食管癌原發部位與化療反應無關聯(P>0.05)，見表1。

表1 175例ESCC患者臨床特征與化療反應的關系[n(%)]

2.2 單核苷酸多態性位點基因型分布

3個單核苷酸多態性位點在175例受試者中均能被明確基因分型。rs907187C/G單核苷酸多態性位點的CC、CG、GG基因型分別為53例(30.3%)、81例(46.3%)和41例(23.4%)，rs8679T/C單核苷酸多態性位點的TT、TC、CC基因型分別為51例(29.1%)、77例(44.0%)和47例(26.8%)，rs1136410T/C單核苷酸多態性位點的TT、TC、CC基因型分別為57例(32.6%)、79例(45.1%)和39例(22.3%)。以上3個單核苷酸多態性位點基因型分布符合群體遺傳學Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.3 單核苷酸多態性位點基因型與化療敏感性的關系

rs8679T/C、rs1136410T/C單核苷酸多態性與化療反應無關(P>0.05)。rs907187C/G單核苷酸多態性與化療反應明顯相關，CC、CG、GG基因型化療有效率分別為12/53(22.6%)、33/81(40.7%)和23/41(56.1%)，差異有統計學意義(χ2=11.116，P=0.004)。CG雜合基因型化療反應率為CC基因型的2.337倍(95%CI：1.068～5.113，χ2=4.516，P=0.034)；GG純合突變基因型化療反應率為CC基因型的4.326倍 (95%CI：1.771～10.565，χ2=10.334，P=0.001)；CG+GG基因型化療反應率為CC基因型的2.881倍(95%CI：1.379～6.019，χ2=7.927，P=0.005)。此外， GG基因型化療反應率明顯高于CG+CC基因型(OR=2.514，95%CI：1.229～5.142，χ2=6.375，P=0.012)，見表2。

表2 rs907187C/G、rs8679T/C和rs1136410T/C單核苷酸多態性位點基因型分布及與化療反應的關系

2.4 單核苷酸多態性位點基因型與患者OS的關系

175例受試者總體中位OS為12.5個月(95%CI：10.912～14.088)。rs8679T/C單核苷酸多態性位點的TT、TC、CC基因型患者中位OS分別為11.6、12.0、14.2個月(χ2=0.955，P=0.620)； rs907187C/G單核苷酸多態性位點的CC、CG、GG基因型患者中位OS分別為10.7、12.8、13.9個月(χ2=0.420，P=0.811)。

rs1136410T/C單核苷酸多態性與患者OS顯著相關，隨著等位基因C數目的增加，患者中位OS逐步延長，TT、TC、CC基因型分別為9.3、13.2、15.6個月(χ2=11.846，P=0.003)；TC+CC基因型攜帶者中位OS為13.9個月，較TT明顯延長(χ2=7.787，P=0.005)，見圖1。

圖1 PARP1基因rs1136410多態性位點不同基因型ESCC患者OS曲線對比

使用Cox模型進行多因素分析(納入年齡、吸煙史、飲酒史、分化程度、腫瘤部位及單核苷酸多態性)，結果顯示rs1136410T/C單核苷酸多態性仍是影響ESCC患者OS的獨立預后因素(OR=1.717，95%CI：1.208～2.440，χ2=9.088，P=0.003)。

3 討 論

DDP是治療晚期ESCC最常用的化療藥物之一，常與紫杉烷或氟尿嘧啶類藥物組成聯合方案。然而，晚期ESCC對化療反應存在明顯異質性，半數以上患者對化療耐藥，導致預后不良。DDP進入細胞后作用靶點是DNA，可形成鉑-DNA加合物，導致DNA鏈交叉連接，阻斷DNA復制和轉錄、促進凋亡[9]。此外，研究已證實DNA修復能力增強是DDP耐藥的主要原因[10]。PARP1是眾所周知的DNA修復蛋白，在堿基切除修復通路中發揮重要作用[2]。研究顯示，PARP1表達減少使食管癌細胞對化療的敏感性增強[4]。同時，PARP1表達變化還能影響食管癌患者的生存預后[6]。所以，筆者猜測PARP1基因單核苷酸多態性可能與轉移性ESCC患者DDP化療反應及OS相關。

rs907187C/G單核苷酸多態性位于PARP1基因啟動子區，含有E2F1轉錄因子的結合位點。熒光素酶報告顯示，rs907187多態性位點的G等位基因與E2F1結合親和力低，導致啟動子活性下降，并降低神經母細胞瘤細胞株PARP1-mRNA的表達水平 (P=0.003)；基因型組織表達分析也發現G等位基因與較低的PARP1蛋白表達相關(P<0.001)[7]。研究顯示，在伊朗人群中，rs907187多態性位點的CC及GG基因型攜帶者發生乳腺癌的風險顯著增高[11]。此前，AVITABLIE等[7]對意大利神經母細胞瘤患者進行研究，發現rs907187多態性位點的G變異等位基因攜帶者擁有更好的化療反應(P=0.02)。本研究也發現了類似的結果，隨著rs907187多態性位點的G等位基因數目的增加，ESCC患者化療有效率逐步升高(CC 22.6%、CG 40.7%、GG 56.1%，P=0.004)；CG+GG基因型化療反應率為CC基因型的2.881倍 (95%CI：1.379～6.019，P=0.005)。根據此前的基因功能學研究[7]，筆者推測rs907187多態性位點變異等位基因G通過影響與E2F1轉錄因子的結合，下調PARP1的轉錄、表達水平，減弱了DNA修復能力，使得癌細胞無法修復DDP誘導的DNA損傷，這可能是G等位基因攜帶者對DDP化療更加敏感的原因。當然，這種推斷仍需更多的單核苷酸多態性功能學研究來證實。

rs8679T/C單核苷酸多態性位于PARP1基因3′-UTR，能影響microRNA與mRNA的結合，進而調控PARP1基因的表達，最終影響結直腸癌的發病風險[12]。然而，最近的研究并未發現該多態性與食管癌發病易感性存在明顯關聯[8]。此外，ZHAO等[13]對卵巢癌患者進行研究，也未發現rs8679T/C單核苷酸多態性與鉑類化療敏感性相關。同樣，本研究也未發現rs8679T/C單核苷酸多態性與ESCC患者化療反應及OS之間存在關聯(P>0.05)。當前，rs8679T/C與腫瘤化療療效之間的研究較少，二者間的真實關系尚不清楚，需開展更多的研究深入探討。

rs1136410T/C單核苷酸多態性屬于非同義多態性，堿基T變異為C后導致編碼的762位氨基酸殘基由纈氨酸(Val)替換為丙氨酸(Ala) ，導致蛋白結構改變，進而影響PARP1蛋白酶的功能[8]。研究顯示rs1136410T/C單核苷酸多態性與卵巢癌化療反應相關， CC基因型患者對鉑類化療敏感，耐藥風險顯著下降(P=0.001)[13]。另外，在一項食管小細胞癌的研究中，發現rs1136410多態性位點變異基因型TC+CC攜帶者的中位OS較野生純合基因型TT患者明顯延長，分別為17.4個月和14.8個月(P=0.032)[14]。這與本研究結果一致，本研究首次發現rs1136410T/C單核苷酸多態性與轉移性ESCC患者OS相關，變異等位基因C攜帶者中位OS明顯延長(P=0.003)；至少攜帶一個C等位基因的患者TC+CC中位OS為13.9個月，較TT明顯延長(P=0.005)。然而，在接受DDP同步放化療的宮頸癌患者中，rs1136410多態性位點變異等位基因C與圍絕經期和絕經后婦女的OS縮短顯著相關(P=0.008)[15]。這與本研究結論并不一致，考慮種族、性別組成、瘤種、腫瘤分期、治療方案的不同導致研究結果存在差異。

綜上所述，本研究發現PARP1單核苷酸多態性能影響轉移性ESCC患者的化療敏感性及生存預后，rs907187多態性位點G等位基因預示更好的化療反應，而rs1136410多態性位點C等位基因與OS延長相關，本研究結果可能對預測轉移性ESCC患者化療反應及預后有一定的作用。