姜黃素對尿道瘢痕成纖維細胞的放療增敏作用及其機制*

鄧 騫，田永峰，段萬里，陳 鑫，潘思源，任 偉， 杜 春△

(1.陜西省人民醫(yī)院泌尿外科，西安 710068；2.西安醫(yī)學(xué)院，西安 710021；3.陜西省人民醫(yī)院放療科，西安 710068)

尿道狹窄是泌尿外科常見疾病，其治療一直是泌尿外科中的一個難點。孫穎浩院士團隊將放療運用于尿道狹窄的預(yù)防和治療，取得了較好的療效，治愈率達到82%[1]，筆者前期的研究也同樣證實了這一療效[2]。盡管腔內(nèi)放療在尿道狹窄的治療上具有一定的安全性，但較大劑量的放射線不僅有導(dǎo)致尿道狹窄復(fù)發(fā)的可能性，而且存在潛在誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險[3-4]。姜黃素是一種被廣泛研究的放療增敏劑，有研究認為姜黃素具有抗纖維化、抑制膠原蛋白產(chǎn)生的作用[5]，但目前暫無學(xué)者研究姜黃素是否對尿道狹窄的放療具有增敏作用。本文擬在體外實驗中驗證姜黃素是否能作為放療增敏劑抑制尿道瘢痕成纖維細胞的增殖及膠原蛋白的合成，并初步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

男性尿道狹窄瘢痕段切除術(shù)后標(biāo)本，標(biāo)本及資料收集均經(jīng)患者本人知情同意，本研究獲得醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)通過；姜黃素購自美國Sigma-Aldrich公司；重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)購自美國R&D公司。蛋白CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自北京全式金生物公司；細胞周期檢測試劑盒及TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗波形蛋白抗體、抗Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白抗體、抗TGF-β1抗體購自英國Abcam公司；抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗、FITC偶聯(lián)二抗購自北京全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1尿道瘢痕成纖維細胞的分離及培養(yǎng)

按照屈衛(wèi)星等[6]所述方法，將組織塊標(biāo)本于含有抗生素的PBS液中反復(fù)沖洗，去除多余的上皮組織；將組織標(biāo)本分解為5 mm×5 mm大小的組織小塊并適當(dāng)向組織上滴加培養(yǎng)基使其保持濕潤。送入離心管中，加入0.25%胰酶消化液-EDTA和膠原蛋白酶-Ⅰ，在37 ℃恒溫水浴箱中消化4～5 h，每小時振蕩1次。將混懸液勻速滴加在燒杯上濾網(wǎng)進行過濾，取濾過后的混懸液170.2×g離心5 min；棄去上清液，加入6 mL的新鮮培養(yǎng)液，充分吹打細胞，于細胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。次日絕大部分成纖維細胞已貼壁，換細胞培養(yǎng)基，每隔2～3 d給細胞換液1次。最終有1例標(biāo)本的尿道瘢痕成纖維細胞被成功分離并培養(yǎng)。選擇波形蛋白作為成纖維細胞的標(biāo)志物進行檢測[7]。

1.2.2放療方法

使用160千伏X射線機在室溫下對細胞進行照射。細胞距離放射源100 cm，劑量率為2 Gy/min，在局部照射裝置的輔助下，照射野尺寸為40 cm×40 cm。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖能力

將細胞接種至96孔板，(1～5)×104/孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁24 h。根據(jù)需求將細胞分組，每組均設(shè)6個復(fù)孔。24 h取出96孔板，于顯微鏡下觀察，并加入CCK-8試劑，孵育2 h；酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(A)值，并記錄結(jié)果。

1.2.4平板克隆實驗

將1×103個尿道瘢痕成纖維細胞接種在6孔板中，待細胞貼壁后棄培養(yǎng)液，根據(jù)需求加入新的培養(yǎng)液或不同濃度的姜黃素處理細胞2 h，暴露于不同劑量的放射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)在孵箱中孵育10～14 d。棄培養(yǎng)液，洗滌、固定及染色后，計數(shù)各孔集落數(shù)(≥50個細胞為1個集落)。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞周期

將尿道瘢痕成纖維細胞接種在6孔板中，待細胞長至70%～80%，根據(jù)需求加入新的培養(yǎng)液或不同濃度的姜黃素處理細胞2 h，暴露于不同劑量的放射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照細胞周期檢測試劑盒說明書處理并收集細胞后，采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞各周期所占比例。

1.2.6TUNEL法檢測細胞凋亡

將20 mm×20 mm蓋玻片置于6孔板內(nèi)，將尿道瘢痕成纖維細胞接種在6孔板中，待細胞長至70%～80%，根據(jù)需求加入新的培養(yǎng)液或不同濃度的姜黃素處理細胞2 h，暴露于不同劑量的放射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出蓋玻片，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒處理，并用DAPI復(fù)染，封片后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.7Western blot定量分析蛋白表達

將尿道瘢痕成纖維細胞接種在6孔板中，待細胞長至70%～80%，根據(jù)需求加入新的培養(yǎng)液或不同濃度的姜黃素處理細胞2 h，暴露于不同劑量的放射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化后將收集的細胞離心并重懸于裂解緩沖液中。冰上孵育30 min 后，提取澄清勻漿 4 ℃、12 000 r/min離心20 min。BCA 蛋白定量試劑盒檢測各組蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，200 mA 濕轉(zhuǎn)120 min，室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)稀釋比例的一抗孵育過夜，洗膜后室溫下孵育二抗1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察并拍照。Quantity One圖像分析軟件分析灰度值，計算出樣本蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 尿道瘢痕成纖維細胞的鑒定

細胞以類梭形和排列較為緊密的扁平狀細胞為主。波形蛋白免疫熒光染色顯示細胞質(zhì)均呈綠色熒光，波形蛋白表達呈陽性，見圖1。

圖1 尿道瘢痕成纖維細胞的鑒定(×200)

2.2 不同濃度姜黃素對尿道瘢痕成纖維細胞增殖的影響

隨著姜黃素濃度的增加，尿道瘢痕成纖維細胞增殖率降低，見圖2。姜黃素作用24 h IC20=19.49 μmol/L，IC50=45.92 μmol/L；48 h IC20=13.68 μmol/L，IC50=30.43 μmol/L。根據(jù)放療增敏劑的選擇原則，選取接近IC20的20 μmol/L姜黃素作用24 h作為放療增敏條件。

圖2 不同濃度姜黃素對尿道瘢痕成纖維細胞增殖的影響

2.3 姜黃素對抑制尿道瘢痕成纖維細胞具有放療增敏作用

姜黃素聯(lián)合放療的細胞生存分數(shù)低于單純放療(P<0.05)，姜黃素對尿道瘢痕成纖維細胞具有放療增敏作用(SER=2.030)，見圖3。根據(jù)細胞生存分數(shù)，選擇較接近IC50的5 Gy作為后續(xù)試驗的放射劑量。20 μmol/L姜黃素+5 Gy放療組細胞克隆數(shù)低于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖3 姜黃素對尿道瘢痕成纖維細胞的放療增敏作用

A：對照組；B：20 μmol/L姜黃素組；C：5 Gy放療組；D：20 μmol/L姜黃素+5 Gy放療組；E:各組細胞克隆數(shù)比較。圖4 姜黃素聯(lián)合放療對尿道瘢痕成纖維細胞克隆形成的影響

2.4 姜黃素聯(lián)合放療對尿道瘢痕成纖維細胞周期分布的影響

與對照組相比，20 μmol/L姜黃素組S期、5 Gy放療組G2/M期細胞比例大幅度增加(P<0.001)。姜黃素和放射聯(lián)合處理后，G2/M期細胞比例進一步增加，而S期細胞比例則處于兩者之間，見表1、圖5。

表1 各組尿道瘢痕成纖維細胞周期分布

A：對照組；B：20 μmol/L姜黃素組；C：5 Gy放療組；D：20 μmol/L姜黃素+5 Gy放療組。圖5 姜黃素聯(lián)合放療對尿道瘢痕成纖維細胞周期分布的影響

2.5 姜黃素聯(lián)合放療對尿道瘢痕成纖維細胞凋亡的影響

對照組、20 μmol/L姜黃素組、5 Gy放療組、20 μmol/L姜黃素+5 Gy放療組細胞凋亡比例分別為(6.54±1.01)%、(16.17±2.28)%、(12.88±2.06)%、(24.92±2.65)%，20 μmol/L姜黃素+5 Gy放療組細胞凋亡比例明顯高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖6。

圖6 姜黃素聯(lián)合放療對尿道瘢痕成纖維細胞凋亡的影響(×200)

2.6 姜黃素聯(lián)合放療對尿道瘢痕成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和TGF-β1的影響

20 μmol/L姜黃素+5 Gy放療組細胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和TGF-β1表達明顯低于對照組(P<0.001)，經(jīng)TGF-β1處理過的細胞Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白合成增加(P<0.001)，見圖7。

A:各組細胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和TGF-β1的表達；B:細胞經(jīng)TGF-β1干預(yù)后Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達的變化；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與其他組比較；△：P<0.05。圖7 姜黃素聯(lián)合放療對尿道瘢痕成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和TGF-β1的影響

3 討 論

尿道狹窄的病因多樣，創(chuàng)傷和醫(yī)源性損傷已成為尿道狹窄最主要的原因。有研究表明，醫(yī)源性尿道狹窄的比例已達45%[8]。尿道狹窄已成為所有尿道和經(jīng)尿道手術(shù)不得不面對的常見并發(fā)癥。尿道狹窄目前的治療方法，如尿道擴張、尿道內(nèi)切開及開放手術(shù)等，均面臨尿道狹窄再復(fù)發(fā)的問題，需多次手術(shù)治療，往往使病變更加復(fù)雜化，治療效果較差。因此，尿道狹窄需要新的治療方法。

早在1906年，BEBEURMAN等就報道采用X射線能有效治療皮膚瘢痕疙瘩。而到1976年，LEVY等[9]術(shù)后應(yīng)用放療有效預(yù)防術(shù)后瘢痕的產(chǎn)生。進入21世紀(jì)，血管內(nèi)介入放療發(fā)展迅速，MALHOTRA等[10]運用銥-192血管內(nèi)放療可明顯降低冠狀動脈支架植入術(shù)后再狹窄的發(fā)生率?；谶@些研究，孫穎浩院士將腔內(nèi)放療應(yīng)用于尿道狹窄的防治，并取得了滿意的效果[11]。國外也有多項研究取得了類似的效果[12-13]。多數(shù)研究的總放射劑量為10～20 Gy，盡管這一劑量被認為不會影響正常組織愈合[14]，但仍有學(xué)者認為它可能存在導(dǎo)致尿道狹窄[15]、尿道瘺[16]甚至誘發(fā)腫瘤[17]的潛在風(fēng)險。因此，在不影響療效的前提下盡量減少放射劑量是腔內(nèi)放療防治尿道狹窄的關(guān)鍵。放射增敏劑是一種化學(xué)或藥物制劑，當(dāng)與放療同時應(yīng)用時可以改變目標(biāo)細胞對放射的反應(yīng)性，從而增加對目標(biāo)細胞的殺傷效應(yīng)，減少放射劑量。

姜黃素是一種從姜黃中分離出來的低分子質(zhì)量多酚類化合物。隨著對姜黃素研究的日益深入，已發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性，且毒性低、不良反應(yīng)小[18]。目前已有大量研究證實姜黃素在肝臟、腎臟、肺等器官中均具有明顯的抗纖維化作用，主要通過促進成纖維細胞凋亡、自噬等實現(xiàn)[19]。另一方面，許多研究者發(fā)現(xiàn)姜黃素可以阻滯腫瘤細胞的細胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，對于多種腫瘤具有放療增敏作用，而對正常細胞則通過抗炎作用發(fā)揮其放療保護作用[20]。但姜黃素在尿道瘢痕導(dǎo)致的尿道狹窄中尚無相關(guān)研究。根據(jù)其抗纖維化作用及放療增敏作用，筆者推測姜黃素可能對尿道瘢痕成纖維細胞也具有放療增敏作用，能協(xié)同放療抑制尿道瘢痕成纖維細胞的增殖。

在尿道瘢痕的形成過程中，成纖維細胞的過度增殖及膠原蛋白合成的異常增多是其主要病理改變，其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白是其主要膠原蛋白類型[3]。在眾多膠原蛋白合成的信號通路中，TGF-β1通路是其中最重要的一條。由于各種外界因素刺激導(dǎo)致的TGF-β1水平上升，活化TGF-β1/Smad通路，促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成[21]。因此，筆者推測姜黃素聯(lián)合放療可能通過抑制TGF-β1通路來減少Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成。

本研究顯示，在體外實驗中姜黃素能作為放療增敏劑，聯(lián)合小劑量放療抑制尿道瘢痕成纖維細胞的增殖，并通過TGF-β1通路抑制Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的合成。這些實驗結(jié)果表明，姜黃素聯(lián)合放療能抑制成纖維細胞的增殖及膠原蛋白的產(chǎn)生，可能對尿道瘢痕的形成具有一定的抑制作用，有望成為尿道狹窄防治的一種新方法。雖然體外實驗已有初步結(jié)果，但還需要體內(nèi)實驗來驗證其療效，其作用的分子機制也有待進一步實驗來探討闡明。