右美托咪定對缺血性腦損傷大鼠神經功能及認知障礙恢復的影響研究

陳金權，趙 娟

(1.咸陽市第一人民醫院麻醉科,陜西 咸陽 712300；2.西安國際醫學中心醫院麻醉手術中心,陜西 西安 710100)

隨著醫學技術的提高，缺血性腦損傷的病死率逐年下降。但是很多患者在治療過程中可出現腦缺血再灌注損傷，導致繼發性腦損傷的問題，認知障礙恢復比較慢，從而嚴重影響患者的康復[1]。腦缺血再灌注損傷的發病機制比較復雜，在臨床上主要表現為神經元急性水腫、壞死及凋亡，涉及到多種細胞因子與基因表達的異常[2]。目前臨床上對于腦缺血再灌注損傷尚未找到理想的治療方法，多采用保守治療方法，能夠在一定程度上挽救患者生命，但是很難持續改善患者的預后[3]。微小RNA(micoRNA,miRNA)可通過控制轉錄因子的翻譯或對染色質的直接作用，從而參加調解基因-環境相互作用。當前miRNA對認知功能的調控研究越來越多，能夠作為潛在的生物標志物用于早期檢測和評估認知功能障礙。micoRNA-329-3p可調控 cAMP 反應元件結合蛋白(Cyclic-AMP response binding protein,CREB)/白介素-1受體拮抗劑(Interleukin-1 receptor antagonist,IL-1RA)軸的表達，而后者具有神經元特異性功能，并參與學習和記憶，還可參與機體的情緒認知、神經突觸可塑性等多項大腦功能[4-5]。抑制CREB/IL-1RA軸的表達可促使機體大量生成一氧化氮，從而誘發抑郁癥、精神分裂癥等精神疾病的發生[6]。右美托咪定是一種α2-腎上腺素受體(α2-Adrenergic receptor,α2-AR)激動劑，可導致交感神經系統遲鈍，也具有高選擇性和高效性，可抑制去甲腎上腺素的釋放，從而產生抗焦慮、鎮靜、鎮痛等作用作用[7]。研究[8-9]表明右美托咪定具有神經保護的功能，能減輕實驗動物短暫性整體或局部腦缺血后的神經損傷，但是具體的機制還有待分析。本文探討了右美托咪定通過協調micoRNA-329-3p/CREB/IL-1RA軸對缺血性腦損傷大鼠神經功能及認知障礙恢復的影響，以明確右美托咪定的作用機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 45只清潔級雄性SD大鼠購自北京維通利華有限公司(批號2323886，體重340 g左右，16～18周，本研究得到了動物倫理委員會的批準)，于清潔動物實驗室飼養，操作過程符合動物倫理要求，實驗室溫度20～28 ℃，相對濕度50%～60%，通風良好，環境安靜，實驗期間自由進食飲水，12 h∶12 h照明，并嚴格遵守有關實驗動物管理與使用的規定。右美托咪定(國藥準字H20090248，批號10110334)，地佐辛(國藥準字H20080329，批號13032221)，酶聯免疫檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司，micoRNA-329-3p檢測體系購自上海Sanson生物工程公司，抗CREB1抗體、抗β-actin抗體、抗IL-1RA抗體購自美國Sigma公司，ZH0065 Morris水迷宮視頻分析系統(北京碩林苑科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 缺血性腦損傷大鼠模型的建立：所有大鼠都建立了大鼠腦缺血再灌注損傷模型，向大鼠腹腔注射4%的水合氯醛，通過右頸內動脈線栓法對大腦中動脈進行阻塞，從而建立缺血性腦損傷大模型[10]。待缺血2 h之后，把線栓輕輕拔出10 mm左右，實現再灌注。

1.2.2 大鼠分組與處理：把建模成功的大鼠(n=45)隨機平分為三組：模型組、地佐辛組與右美托咪定組。右美托咪定組在再灌注即刻腹腔注射右美托咪定40 μg/kg，地佐辛組在再灌注即刻腹腔注射地佐辛40 μg/kg，模型組在再灌注即刻腹腔注射相同容量0.9%氯化鈉溶液。

1.3 觀察指標 ①采用Morris水迷宮實驗評定大鼠學習記憶功能：實驗前第1 天先將大鼠放入水迷宮游泳自己找平臺120 s，并在平臺上休息30 s；手術24 h后開始水迷宮實驗，記錄大鼠在120 s內水中游泳的時間和運動軌跡，記錄從放入水池到找到平臺的時間記為逃避潛伏期，如果超過120 s仍未找到平臺，逃避潛伏期記為120 s，如果找到平臺后爬上平臺并5 s以上，則認為找到平臺。②大鼠神經功能缺陷評分：不能自發行走，意識減退為4分；以追尾狀的形式向左側轉圈為3分；向左側行走為2分；左側前肢內向屈曲為1分；神經功能沒有缺陷為0分。③血清白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6及micoRNA-329-3p表達水平檢測：斷頭處死大鼠，取大鼠的心臟血液0.2 ml左右，不抗凝，靜置30 min后低溫離心10 min(3000 r/min)，取上層血清，采用酶聯免疫吸附測定法檢測血清IL-1β、IL-6表達水平，同時采用qRT-PCR檢測micoRNA-329-3p表達水平。④海馬組織CREB、IL-1RA蛋白相對表達水平檢測：取處死大鼠的大腦海馬組織，剪碎研磨后制成組織勻漿，提取總蛋白，應用Western blot法檢測各組海馬組織CREB1、IL-1RA蛋白的相對表達水平。

2 結 果

2.1 三組逃避潛伏期對比 地佐辛組與右美托咪定組再灌注后第1、3、7天的逃避潛伏期低于模型組(均P<0.05)，右美托咪定組低于地佐辛組(均P<0.05)，見表1。

表1 三組逃避潛伏期對比(s)

2.2 三組神經功能缺陷評分對比 地佐辛組與右美托咪定組再灌注后第1、3、7天神經功能缺陷評分低于模型組(均P<0.05)，右美托咪定組低于地佐辛組(均P<0.05)，見表2。

表2 三組神經功能缺陷評分對比(分)

2.3 三組血清IL-1β、IL-6及micoRNA-329-3p表達水平對比 地佐辛組與右美托咪定組再灌注后第7天的血清IL-1β、IL-6表達水平與micoRNA-329-3p相對表達水平低于模型組，且右美托咪定組比地佐辛組更低(均P<0.05)，見表3。

表3 三組血清IL-1β、IL-6及micoRNA-329-3p表達水平對比

2.4 三組海馬組織CREB、IL-1RA蛋白相對表達水平對比 地佐辛組與右美托咪定組再灌注后第7天大腦海馬組織CREB、IL-1RA蛋白相對表達水平高于模型組(均P<0.05)，右美托咪定組高于地佐辛組(P<0.05)，見表4。

表4 大鼠海馬組織CREB、IL-1RA蛋白相對表達水平對比

3 討 論

缺血性腦損傷為臨床上常見的致殘與致死性疾病，特別是當前腦缺血再灌注損傷也比較常見，嚴重影響患者的康復。地佐辛是κ受體激動劑，也是μ受體拮抗劑，對機體有一定的認知功能損害作用，因而成癮性小被列入非麻醉品范疇[11]。右美托咪定是一種高選擇性的α2-腎上腺素受體激動劑，其然能夠致交感神經系統遲鈍，從而產生相應的鎮靜與抗焦慮作用，但是其起效迅速，清除率快且幾乎對呼吸無影響。有研究顯示右美托咪定能在穩定血流動力學、抑制自主神經反射和減少麻醉藥用量等方面具有重要作用，能減輕氣管插管所引起的血流動力學紊亂如心律增快等不良反應，具有很好的應用安全性[12-13]。Morris水迷宮實驗是目前比較公認的評價嚙齒類動物學習記憶的一種實驗手段，其可配套有電腦系統，可同步自動記錄大鼠運動軌跡及尋找平臺的時間等，更加有利于進行認知功能的判斷。本研究顯示地佐辛組與右美托咪定組再灌注后第1、3、7天逃避潛伏期、神經功能缺陷評分低于模型組，右美托咪定組低于地佐辛組，表明右美托咪定的應用能減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能缺陷，提高大鼠的記憶能力。從機制上分析，右美托咪定與腎上腺受體不易結合，對呼吸功能的抑制較輕，能減輕大鼠腦神經細胞凋亡，降低大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織內谷氨酸含量，發揮其腦保護作用[14]。右美托咪定還可使大鼠的腦內脂質過氧化物水平降低，并減少腦內還原型谷胱甘肽，可通過調節抗氧化水平發揮腦保護作用[15]。

腦缺血再灌注損傷的病理生理嚴格來講是一個酶促級聯反應，涉及到細胞凋亡、熱休克蛋白、補體、細胞因子等[16]。過度的炎癥反應是神經損傷的重要機制之一，在急性腦損傷中，小膠質細胞和星形膠質細胞活化，釋放促炎性因子和趨化因子，從而加重腦損傷。microRNA是一類小的、非編碼的單鏈RNA分子，是全身炎癥及免疫應答的有效調節因子。micoRNA-329-3p是在免疫系統中具有調節作用的miRNA，抑制micoRNA-329-3p的表達對防止過度炎癥起重要作用[17]。本研究顯示地佐辛組與右美托咪定組再灌注后第7天的血清IL-1β、IL-6表達水平與micoRNA-329-3p相對表達水平低于模型組，右美托咪定組低于地佐辛組，表明右美托咪定的應用能抑制腦缺血再灌注損傷大鼠micoRNA-329-3p的表達，還可抑制嚴重炎癥因子的表達。從機制上分析，右美托咪定具有顯著的抑制炎癥作用，可有效降低促炎性因子和趨化因子的表達。還有研究顯示右美托咪定可通過調控miRNA水平抑制細胞凋亡而發揮組織器官保護作用，還能調控大鼠腦內多種miRNA的表達，從而發揮腦保護作用[18-19]。

CREB/IL-1RA軸是機體的重要轉錄因子體系之一，調控許多基因的表達，存在于多種組織中，對于炎癥因子的表達調控發揮重要作用。CREB/IL-1RA軸 可促進記憶涉及新的突觸聯系生長，在調節樹突生長等方面也發揮重要作用[20-21]。本研究顯示地佐辛組與右美托咪定組再灌注后第7天的大腦海馬組織CREB1、IL-1RA蛋白相對表達水平高于模型組，右美托咪定組高于地佐辛組，表明右美托咪定的應用能促進腦缺血再灌注損傷大鼠CREB、IL-1RA蛋白的表達。從機制上分析，右美托咪定能抑制腺苷酸環化酶活性和環磷腺苷的合成，導致突觸活動減少，產生突觸前抑制，從而促進CREB、IL-1RA蛋白的表達。當前有研究表明右美托咪定能有效的減輕缺氧復氧誘導的體外培養神經元細胞凋亡的發生，也能減輕順鉑誘導的海馬神經元的損傷[22]。不過本研究也存在一定的不足，缺少對右美托咪定劑量、保護作用的量效關系進一步研究，未對其細胞學進行分析。

總之，右美托咪定可通過協調micoRNA-329-3p/CREB/IL-1RA軸的表達，促進缺血性腦損傷大鼠神經功能及認知障礙恢復正常，具有很好的腦保護效果。