小白菊內酯對骨肉瘤細胞凋亡與凋亡相關蛋白的影響及作用機制研究

紀 濤,任建政,李正華,陳小龍

(1.武警陜西省總隊醫院，陜西 西安710054；2.陜西省人民醫院，陜西 西安710068)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)作為一種原發性惡性腫瘤，起源于人體骨骼形成和發展過程，發病人群一般為青少年，全球年發病人數高達4～5萬，且呈逐年上升趨勢[1-2]。臨床中針對骨肉瘤患者，常采用放療和化療等保守方法治療，必要時需要進行手術切除。盡管在一定程度上緩解了病情發展，但是復發性骨肉瘤患者和轉移性骨肉瘤患者尚不能得到徹底治愈[3-4]。所以，尋找新穎、廉價高效的藥物用于臨床治療骨肉瘤顯得極為迫切。小白菊內酯(Parthenolide,PTL)是一種倍半萜類化合物，單體可從菊科植物中提取獲得，具有顯著的抗炎癥和抗腫瘤作用，因其來源豐富、價格低廉、獲取成本低、不良反應小的特點而廣受科研工作者的青睞[5]。然而，PTL對骨肉瘤的作用及分子機制尚不清楚。本研究檢測PTL對體外培養的骨肉瘤細胞活性和凋亡的作用，通過細胞和分子水平探究PTL促進骨肉瘤細胞凋亡的作用及信號通路，為臨床防治骨肉瘤提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 PTL(批號552337)購自北京百靈威科技有限公司，人骨肉瘤細胞(U2OS細胞)購自上海信裕生物技術有限公司，DMEM培養基、青霉素/鏈霉素均購自Gibco公司，血清購自美國康寧公司，Bax(批號A00183)、Caspase 3(批號BA2142)、Bcl-2(批號A00040-2)單克隆抗體均購自武漢博士德公司，Cleaved-Caspase 3(批號ab32042)購自英國Abcom公司，TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒(批號QIA33)抗體購自美國Sigma-Aldrich公司，轉膜儀(型號：TY-201-01)購自南京中科通儀公司，Real time RCR儀(型號qTOWER 2.0)購自德國耶拿公司，拍照顯微鏡(型號XSP-63)購自寧波湛京公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PTL對骨肉瘤細胞活力的影響：骨肉瘤細胞用α-DMEM完全培養基培養(含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素)，細胞復蘇后，待細胞鋪滿瓶底，加入胰酶，消化2 min，之后加入培養基終止，離心并重懸細胞，得到濃度為1×104/ml的細胞懸液。使用96孔板培養細胞，每孔加入200 μl細胞懸液，待細胞貼壁后，使用PTL濃度以此為0、5、10、20、40 μmol/L的培養基培養24 h，10 μl CCK-8反應液逐孔加入，培養箱孵育1 h，用酶標儀檢測細胞吸光度(波長設置為490 nm)。

1.2.2 流式細胞雙重染色法檢測細胞凋亡：向T-25培養中加入5 ml培養液(細胞濃度為1×105/ml)，實驗分為：對照組(0 μmol/L PTL組)；PTL組(5、10、20、40 μmol/L)，培養時間結束后，收集細胞，細胞與FITC-AnnexinV+ PI反應液，避光孵育10 min，然后上機，進行細胞凋亡檢測，每個樣品重復測定3次，并進行統計分析。

1.2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡：將潔凈的玻片置入6孔板，用吸管吸取賴氨酸對玻片進行涂抹處理，放入培養箱過夜，次日加入濃度為104/ml的細胞懸液，每孔2 ml，待細胞貼壁后，換用含PTL(20 μmol/L)或不含PTL的培養基。培養24 h后，經4%多聚甲醛固定，進行細胞凋亡檢測，步驟參看TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒。

1.2.4 蛋白印跡法檢測Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3、Caspase 3蛋白表達：待細胞(105/孔)貼壁后，換用含PTL或不含PTL的培養基，培養24 h后，用細胞刮收集細胞，置于冰上，每管加入RIPA裂解液300 μl，經離心，變性得到蛋白樣品。使用伯樂電泳設備進行SDS電泳和半干轉，最終蛋白完整地轉移到PVDF膜上，PVDF膜經過PBST浸泡和洗滌，用5%脫脂牛奶封閉1 h，用一抗稀釋液稀釋抗體得到 Bcl-2(1∶1500)、Bax(1∶1500)、GAPDH(1∶3000)、Cleaved-Caspase 3(1∶1500)和Caspase 3(1∶1000)一抗稀釋液，抗體完全浸沒PVDF膜后，在搖床上4 ℃孵育過夜，次日，將膜用PBST洗滌3次后，加入顯色液，使用伯樂ECL成像儀顯色，拍照，用Image Lab6.0軟件進行定量分析。

1.2.5 Real time PCR檢測Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3、Caspase 3 mRNA表達：細胞處理分組和步驟與1.2.4一致。培養24 h后，移除培養基，用1 ml Trizol裂解細胞5 min，收集至離心管，經過離心沉淀等步驟，得到RNA，用DEPC處理過的純水溶解RNA。按照TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒，將反應液、引物和cDNA模板按照比例混勻并加入96孔板，使用德國耶拿Qtower96G熒光定量PCR儀進行檢測并分析。各基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列

2 結 果

2.1 PTL對骨肉瘤細胞活力的影響 見圖1。CCK-8結果表明，PTL濃度為5、10 μmol/L時，對骨肉瘤細胞活性沒有顯著抑制作用(均P>0.05)。隨著PTL濃度梯度增加，當PTL濃度為20、40 μmol/L時，PTL對骨肉瘤細胞活性的抑制作用明顯增加，與對照組相比，其差異均具有統計學意義(均P<0.05)，但20、40 μmol/L PTL對骨肉瘤細胞的抑制作用比較無統計學差異(均P>0.05)。

注：與對照組相比，*P<0.05

2.2 PTL對骨肉瘤細胞凋亡的影響 見表2(圖2)。10、20 μmol/L的PTL對細胞凋亡無顯著影響(均P>0.05)。隨著濃度的增加，PTL(20、40 μmol/L)顯著促進細胞凋亡，與對照組相比差異具有統計學意義(均P<0.05)，但20、40 μmol/L PTL對骨肉瘤細胞的促凋亡作用無統計學差異(均P>0.05)，因此，在本研究中，后續實驗均采用20 μmol/L PTL。采用TUNEL法檢測細胞凋亡，PTL顯著促進骨肉瘤細胞凋亡，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組間細胞凋亡率比較(%)

注：與對照組相比，*P<0.05

2.3 PTL對骨肉瘤細胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3、Caspase 3 mRNA和蛋白表達的影響 見圖3、4。結果顯示，20 μmol/L PTL 顯著上調骨肉瘤細胞促凋亡蛋白Bax mRNA和蛋白水平表達(均P<0.05)，顯著抑制抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白水平的表達(均P<0.05)。Caspase 3作為細胞凋亡的最終執行者，20 μmol/L PTL顯著促進Caspase 3 mRNA和Cleaved-Caspase 3蛋白表達上調(均P<0.05)，且促進Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比值上調(P<0.05)，最終致使骨肉瘤細胞發生凋亡，與對照組相比，其差異均具有統計學意義(均P<0.05)。

注：與對照組相比，*P<0.05

注：與對照組相比，*P<0.05

3 討 論

文獻[6]報道，PTL具有優異的抗癌活性，且對正常細胞無不良反應。大量研究[7]證明，PTL對多種腫瘤細胞均具有抗腫瘤作用。本研究通過細胞活性實驗和流式細胞凋亡實驗發現，低濃度的PTL(5、10 μmol/L)對骨肉瘤細胞活力無顯著影響，20、40 μmol/L PTL可以有效促進骨肉瘤細胞凋亡，但兩組間差異無統計學意義。因此后續實驗采用20 μmol/L為工作濃度。通過Western blot和Real time PCR檢測PTL對骨肉瘤細胞凋亡相關蛋白及基因表達的影響。

凋亡，是由眾多細胞內外信號通路參與調控，各種細胞轉錄因子和凋亡信號傳導通路傳至細胞內，通過轉錄激活，激活靶基因產生效應，引起凋亡，是由調控細胞，維持細胞新陳代謝的重要機制[8]。細胞凋亡可以由不同的刺激物誘導，例如細胞毒性藥物、輻射和缺氧應激。藥物誘導腫瘤細胞凋亡是目前腫瘤研究的熱點[9]。Bcl-2具有抗凋亡的功能，Bax具有促凋亡的功能[10-12]，它們均屬于Bcl-2家族蛋白。細胞凋亡的走向取決于Bax/Bcl-2比值。本研究中，PTL顯著促進促凋亡Bax，并抑制Bcl-2的表達，骨肉瘤細胞內Bax/Bcl-2比例升高，引發細胞凋亡。

文獻報道，Caspase 系列酶激活在Fas 引發的外源性凋亡過程中發揮著重要的作用[13]， Caspase 8 的活化是反應的起始酶，Caspase 8的活化作為中間酶激活下游酶Caspase 9和Caspase 3[14]。Caspase 3作為細胞凋亡的關鍵酶，也是最著名的細胞凋亡標志物之一，是細胞凋亡的最終執行者，Caspase 3一旦被激活,預示著細胞凋亡的發生將不可逆轉[15-17]，Cleaved-Caspase 3是Caspase 3蛋白水解產物。Caspase 3一旦被水解活化，就會轉移到細胞核中，在細胞核切割特定的底物。本研究中，用PTL處理骨肉瘤細胞后，發現相比對照組，處理組細胞凋亡百分比顯著增加，而Western blot和Real time PCR結果也顯示Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比值上調，該結果從分子水平證實PTL促進骨肉瘤細胞發生凋亡。

有文獻報道，PTL可通過上調 Bax 和降低Bcl-2 mRNA 表達誘導人前列腺癌細胞PC-3發生凋亡[18],也有研究顯示，PTL通過促進 HepG2細胞內產生活性氧，進而引發細胞凋亡[19]。也有研究表明PTL通過誘導BGC-823細胞周期產生阻滯并促進細胞凋亡，PTL的抗腫瘤作用可能抑制了STAT3/E2F1信號通路[20]，本研究證實PTL通過增加Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比值誘導骨肉瘤細胞凋亡，在后續研究中，需要進一步從活性氧和細胞周期方面對PTL的促凋亡作用進行深入研究。

本研究證實PTL下調Bcl-2，上調Bax表達、最終導致Cleaved-Caspase 3/Caspase 3比例上調,引發骨肉瘤細胞發生凋亡，因此，本研究為PTL用于臨床治療骨肉瘤提供了理論依據。