內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在丙肝病毒感染發(fā)病學中作用的研究進展

李明皓，范亮亮，項 榮

(中南大學 湘雅醫(yī)學院，湖南 長沙 410013)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)屬黃病毒科的包膜陽性RNA病毒[1]，其遺傳物質(zhì)9 500～10 000 bp，通常不整合到宿主基因組，能編碼長為3 014個氨基酸的蛋白前體，后者經(jīng)過蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生核心蛋白、包膜蛋白E1、E2及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(表1)[2]。全世界約有3%的人感染HCV，HCV感染可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌[3]，已成為重大的公共衛(wèi)生問題之一。肝細胞內(nèi)HCV基因組表達導致大量病毒蛋白和RNA復制中間產(chǎn)物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，從而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，為緩解ERS， 細胞將激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)以消除感染促進細胞回歸穩(wěn)態(tài)；但UPR也可被病毒操縱，深化感染并減弱抗病毒反應[4]。當ERS太劇烈難以通過UPR緩解時，細胞將激活凋亡通路。在HCV感染的過程中，ERS介導的UPR可使肝細胞核因子4α和其下游的具有抑癌作用的miR-122表達水平均被調(diào)低，從而導致腫瘤的發(fā)生，這也是HCV感染發(fā)展為肝細胞癌的原因[5]。因此，探明病毒感染與宿主細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用機制對丙型肝炎病毒感染的治療意義重大。

表1 HCV相關(guān)蛋白功能Table 1 Functions of HCV related proteins

1 HCV感染與ERS和UPR

1.1 ERS介導的UPR反應及其相關(guān)通路

為緩解ERS的有害影響，細胞會激活UPR通路。在人體細胞中，UPR一般由3個分子介導：PERK(蛋白激酶R受體樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶)、IRE1(需肌醇酶1)和ATF6(激活轉(zhuǎn)錄因子6)。這3個分子一般與GRP78(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留伴侶分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78)結(jié)合；當錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積累時，3個分子與GRP78分離，激活下游相關(guān)通路[6]，分述如下。

當細胞發(fā)生ERS時，PERK被激活，并使eIF2(真核細胞翻譯起始因子2)的亞單位eIF2a磷酸化。活化的eIF2a可誘導翻譯抑制并增加ATF4(激活轉(zhuǎn)錄因子4)表達，ATF4可以激活GADD34(增殖停滯和DNA損傷誘導蛋白34)的表達，從而招募PP1使eIF2a去磷酸化并削弱其介導的翻譯抑制，形成負反饋調(diào)節(jié)[7]。ATF6是一種BZip轉(zhuǎn)錄因子，作為跨膜蛋白，當ERS發(fā)生時，其移入高爾基復合體并激活。活化ATF6可入核，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊相關(guān)基因表達：如ER伴侶、蛋白二硫化物異構(gòu)酶等。IRE1-XBP1通路起始于IRE1的激活，活化的IRE1從XBP1(X盒結(jié)合蛋白1)mRNA中剪除26個核苷酸的內(nèi)含子[8]，剪切后的XBP1被翻譯后作為轉(zhuǎn)錄因子，增強相關(guān)基因表達，促進ER相關(guān)蛋白降解(ER associated protein degrada-tion，ERAD)。剪切后的XBP1還能夠激活p58ipk，而p58ipk可削弱PERK磷酸化eIF2a的能力[9]。IRE1的亞基IRE1B還可通過其RNA酶活性參與IRE1依賴性衰變(regulated IRE1 dependent decay，RIDD)途徑，降解ER結(jié)合的mRNA，減少蛋白質(zhì)翻譯并限制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊的蛋白質(zhì)負荷，調(diào)節(jié)ERS[10]。

1.2 HCV感染與ERS介導的UPR

在晚期丙型肝炎患者和病毒性肝硬化患者中，HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B對UPR通路的激活作用是目前已知最強的，其可使ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基復合體，可激活ATF6；還可激活XBP1的剪切從而觸發(fā)UPR[11]。此外，尚有研究表明NS4b還可以通過誘導IRE1的磷酸化從而誘導UPR的發(fā)生[12]。在酵母模型中的研究還表明，HCV未成熟的核心蛋白可通過ERAD誘發(fā)UPR[13]。當包膜蛋白E1和E2積聚在ER中時，GRP78與其相互作用。從E1和E2中去除信號肽，可將這些蛋白質(zhì)定向表達到細胞質(zhì)，這些細胞質(zhì)靶向的E1/E2可通過誘導XBP1的合成和剪切誘導UPR[14]，此外，E1還可以通過抑制PERK對UPR起到抑制作用[15]。目前關(guān)于HCV其他蛋白組分激活UPR的機制尚不明確，通過已發(fā)現(xiàn)的UPR激活途徑，可知病毒蛋白通過對UPR通路中各感知蛋白的活性調(diào)節(jié)，對UPR進程進行調(diào)節(jié)，在病毒減弱細胞抗病毒反應的同時，使感染細胞維持一定程度的穩(wěn)態(tài)，以深化感染，增強侵襲力。

PERK-eIF2a途徑能降低胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的整體水平，但HCV仍能翻譯mRNA，因為HCV能自行招募和組裝起始核糖體復合物，并通過激活eIF2a并磷酸化PP1，誘導其調(diào)節(jié)亞單位GADD34來抑制eIF2a活化；上調(diào)其抑制劑p58ipk的轉(zhuǎn)錄來抑制PERK的活性，其包膜蛋白E2甚至可作為PERK的偽底物來隔離其活性。

HCV亞基因組復制子可通過抑制剪切后XBP1的合成來抑制IRE1-XBP1途徑，這可能有助于增強病毒蛋白的合成和持續(xù)感染。

2 HCV感染與ERS相關(guān)細胞凋亡

2.1 ERS相關(guān)細胞凋亡通路

ERS劇烈，在難以通過UPR緩解時，細胞便激活凋亡通路。PERK-eIF2a-ATF4通過激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)，上調(diào)BH3-only蛋白表達和下調(diào)抗凋亡蛋白發(fā)揮促凋亡作用。此外，CHOP可激活死亡受體5、Tribbles相關(guān)蛋白3、GADD34和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶1a觸發(fā)凋亡，其中，GADD34和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶1a通過影響活性氧物簇的積累調(diào)節(jié)凋亡。激活的PERK通過增強含有抗氧化反應元件基因表達來保護細胞。IRE1也可通過IRE1-TRAF2-JNK通路促進凋亡。活性IRE1與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-2相互作用，然后磷酸化JNK(Jun氨基末端激酶)[16]，連接JNK與凋亡的介質(zhì)是Bcl-2家族：抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1)，促凋亡蛋白(Bax、Bak)和促凋亡的BH3-only蛋白(Bad、Bim、Bid、Noxa、Puma)[17]。BH3-only蛋白對于抗凋亡蛋白介導的Ca2+釋放是必要的，釋放的Ca2+可被線粒體吸收，導致細胞色素C外流，引起細胞凋亡。JNK磷酸化抗凋亡蛋白以降低其活性，磷酸化BH3-only蛋白質(zhì)以增強其活性[18]。此外，RIDD的持久激活可能通過降解基本蛋白的mRNA而引起凋亡[10](圖1)。

2.2 HCV蛋白對凋亡通路的調(diào)節(jié)

HCV的不同蛋白組分可通過與凋亡通路之中的相關(guān)感知蛋白結(jié)合，進而調(diào)節(jié)病毒感染和細胞存活或凋亡之間的平衡，為病毒進行持續(xù)感染創(chuàng)造條件(圖1)。

A.HCV中不同種類蛋白對UPR通路的調(diào)節(jié); B.HCV中不同蛋白對凋亡通路的調(diào)節(jié)[27]圖1 HCV中不同種類蛋白對相關(guān)通路的調(diào)節(jié)Fig 1 Regulation of correlated pathways by different protiens in HCV

2.2.1 HCV核心蛋白與凋亡：核心蛋白構(gòu)成的核衣殼可激活與各種細胞信號通路有關(guān)的不同的啟動子，發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，核心蛋白通過阻止線粒體釋放細胞色素C并抑制caspase-9、caspase-3、caspase-7的級聯(lián)激活來抗凋亡；也可與p53結(jié)合，發(fā)揮抗凋亡作用[19]；核心蛋白還可通過磷酸化激活STAT3來抑制肝癌細胞凋亡[20]。核心蛋白也可間接激活Bax來誘導凋亡。

2.2.2 包膜蛋白E1和E2與凋亡：E1和E2是包膜蛋白，能介導病毒結(jié)合進入細胞[21]。在表達HCV蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，CD95配體介導的肝細胞凋亡分別受到E1和E2的抑制，細胞色素C釋放和caspase-9激活也受E2抑制；在表達E1的肝細胞中，E1的C端跨膜域可能使膜通透性得以改變，從而導致凋亡。

2.2.3 非結(jié)構(gòu)蛋白與凋亡：非結(jié)構(gòu)蛋白NS2和NS3是蛋白裂解所需的兩種蛋白酶[22]。NS2是一種跨膜蛋白，定位于ER內(nèi)，其在肝細胞凋亡和病毒性肝炎中的作用仍不明確。

NS3具有螺旋酶和三磷酸酶活性，通過抑制ROS累積與特異性分解下游Cardif蛋白可阻止病毒RNA誘導的RIG-I促凋亡效應。此外，NS3在肝細胞和樹突狀細胞中誘導caspase-8依賴性凋亡[23]。

NS4a是一種與NS3結(jié)合的輔因子，可單獨存在或與NS3復合存在，通過誘導細胞色素C釋放和caspase-3激活凋亡[24]。NS4b是一種完整的ER膜蛋白，在錨定復制復合體中起到作用，在其凋亡信號通路中的作用尚未明確。

NS5a可干擾對干擾素的反應，在病毒復制中起重要作用。NS5a與Bcl-2序列同源，與FKBP38結(jié)合，可增強Bcl-2家族的抗凋亡作用[25]，抑制Bax在肝癌細胞中的促凋亡作用[26]。NS5a的抗凋亡作用還可通過p53的細胞質(zhì)隔離過程等介導[26]。NS5b是病毒RNA依賴性RNA聚合酶，暫時還沒有NS5b在肝細胞凋亡中的研究。

3 問題與展望

ERS可作為HCV病毒感染過程中的檢測指標。ERS相關(guān)基因的表達與病毒性肝炎發(fā)病機制密切相關(guān)，在病毒誘導的細胞凋亡和炎性反應中起重要作用，但目前對HCV中的一些蛋白(如NS2等)具體調(diào)控ERS相關(guān)通路的分子機制尚不明確，有待進一步研究。因此，未來可通過體內(nèi)外實驗，尋找更多與HCV感染和與病毒性肝炎發(fā)病相關(guān)的ERS靶基因并深入研究HCV中蛋白組分激活ERS的相關(guān)機制，從而探討發(fā)掘出相應的基因治療方法或靶點的可能性，以獲得更有效、更有針對性的預防和治療病毒性肝炎的藥物和方法，減少甚至逆轉(zhuǎn)病毒感染對人體細胞帶來的損害。