二氫楊梅素對實驗性結腸炎小鼠調節性B細胞的影響

李小麗，陳慧玲，王小春，韓悌云,3*，張德奎*

(1.蘭州大學第二醫院 消化內科 甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅省人民醫院 消化內科, 甘肅 蘭州 730000;3.蘭州大學第二醫院 消化疾病重點實驗室, 甘肅 蘭州 730000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性、復發性、難治性自身免疫性腸道疾病[1-2]，約50%的UC患者疾病反復發作，嚴重影響生活質量[3]。目前UC的治療是臨床上面臨的難題，因此尋找一種有效的治療藥物迫在眉睫。 二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)是從顯齒蛇葡萄中分離出來的一種天然黃烷醇化合物，據報道具有抗感染、抗腫瘤、抗酒精的作用[4]。

免疫系統紊亂是近年來UC的研究熱點，傳統觀點認為UC疾病進展中免疫細胞介導的免疫應答導致促炎因子的產生和結腸組織的破壞，其中B細胞發揮重要作用[5-6]。然而，近年來研究發現B細胞在自身免疫疾病中具有調節作用，并將這種特殊的B細胞定義為調節性B細胞(regulatory B cell，Breg)[7]。Breg主要通過產生抗炎因子白介素10(interleukin 10，IL-10)及轉化因子β(transforming growth factor,TGF-β)在潰瘍性結腸炎、慢性炎性和癌等疾病中發揮調節作用，但是在結腸炎中的相關研究甚少，考慮到Breg細胞功能障礙在UC中的重要性，需要進一步研究Breg參與疾病進程的機制[3, 8-9]。本研究主要探討DHM對實驗性結腸炎小鼠Breg的影響及可能機制，為結腸炎的治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雌性BALB/c小鼠24只，6～8周齡，體質量(20±2)g(中國農業科學院蘭州獸研所)，飼養于蘭州大學第二醫院SPF級動物實驗室(倫理批號：D2019-104)。二氫楊梅素(成都曼斯特生物科技有限公司)；RT-qPCR引物(蘭州天啟基因生物科技有限公司)；美沙拉嗪(Mesalazine)(0.5 g/袋，上海愛的發制藥有限公司)；葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium Salt, DSS，Yeasen Biotech有限公司，分子質量：3.6～5.0 ku)；4%組織固定液(北京索萊寶科技有限公司)；CCK8(Biosharp公司)；APC抗鼠CD5抗體、FITC抗鼠CD1d抗體和PerCP/Cyanine5.5抗鼠CD19抗體(Biolegend公司);Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ及SYBR Grennm Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒(艾瑞科生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠隨機分為正常組(normal)、DSS組、DSS+DHM組、DSS+mesalazine組(造模采用4% DSS連續飲用7 d)。7 d后，每天分別給予灌胃水(0.2 mL/d)、DHM(40 mg/kg·d)和美沙拉嗪(520 mg/kg·d)。

1.2.2 小鼠疾病活動性指數(disease activity index，DAI)評分：每日觀察小鼠糞便性狀及黏稠度。根據以下標準給糞便中的出血評分(0：無； 2：可見的糞便中有血跡； 4：直腸出血)。 糞便稠度評分確定如下(0：正常； 1：柔軟但仍形成； 2：非常柔軟； 3：半腹瀉； 4：腹瀉)[10-11]。

1.2.3 HE染色及大體標本的觀察：取小鼠全結腸量取長度后，置于4%組織固定液固定，常規石蠟包埋后進行HE染色，高倍鏡下(×200)選擇多個視野進行觀察。HE染色切片采用盲法評估，根據炎性反應和隱窩損傷進行病理學評估(表1)[11]。

表1 病理學評分Table 1 Pathology score

1.2.4 脾臟單細胞懸液及流式染色：將新鮮脾臟置于冰上研磨后，1 000×g離心10 min，棄上清重懸，取10 μL細胞懸液使用血細胞計數板計數。將每個組制備好的脾臟單細胞懸液分為空白管、CD19單染管、CD5單染管、CD1d單染管、CD19 CD5 CD1d三染樣本管及CD19 CD5 CD1d同型對照管。每個管中各取4×107個細胞懸液，根據分組加入對應抗體，避光孵育30 min，各加入900 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，行流式細胞儀(Canto, BD Biosciences)檢測。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 檢測脾細胞中細胞因子的mRNA：用Trizol試劑(Ambion)提取脾臟細胞總RNA。RNA在oligo dT引物的存在下，用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。使用SYBR Grennm Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒在Roche LightCycle 96系統上進行定量PCR。循環參數為:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,40個循環;95 ℃ 5 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 1 s、最后60 ℃ 30 s。結果用2-△△Ct計算。PCR引物見表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequence for RT-qPCR

1.2.6 CCK8檢測脾臟細胞的增殖：將脾臟單細胞懸液以5×103個/100 μL分別接種于96孔板，加入不同濃度梯度的DHM(0、2.5、5、10、20、40、80、160、 320和640 μmol/L)于37 ℃培養箱(配搖床)分別作用24和48 h，每孔加入20 μLCCK8溶液，37 ℃細胞培養箱孵育2～4 h后酶標儀檢測450 nm吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠一般情況評估

與對照組比較，給予DSS后第4天，小鼠開始出現明顯的精神狀態欠佳，毛發稀疏成簇，肛門處可見明顯肉眼血便，體質量出現明顯下降(圖1A)，DAI評分明顯升高(圖1B)；與DSS組比較，DSS+DHM與DSS+mesalazine組小鼠出現明顯體質量增加(圖1A)，DAI評分降低(P<0.05)(圖1B)。

A.daily weight change of mice; B.disease activity index圖1 各組小鼠體質量變化及DAI評分Fig 1 Change of body weight and DAI scores of mice in each

2.2 各組小鼠結腸大體形態及光鏡下病理學的比較

在大體形態上，DSS組小鼠結腸可見明顯的水腫和腸道出血，結腸黏液血便不易剝離。結腸長度比較DSS

A.colon gross morphology image; B.comparison of colon length among groups; C.HE staining; D.pathological score;*P<0.05 compared with normal; #P<0.05 compared with DSS圖2 各組小鼠結腸及HE染色Fig 2 Colon and HE staining in each group of

2.3 小鼠脾臟單細胞懸液中CD19+B淋巴細胞和Breg(CD19+CD5+CD1d+)比例的比較

與對照組比較， DSS組CD19+B細胞比例明顯降低，與DSS組比較，DSS+DHM組和DSS+mesalazine組明顯升高(P<0.05)(圖3A，B)；與對照組比較， DSS組Breg細胞比例明顯降低，與DSS組比較，DSS+DHM組和DSS+mesalazine組明顯升高(P< 0.05)(圖3C，D)。

A, C.flow cytometry analysis of CD19+B cells and Breg; B,D.quantitative analysis, *P<0.05 compared with normal; #P<0.05 compared with DSS group圖3 各組脾臟CD19+B cells和Breg細胞的比例Fig 3 Ratio of CD19+B cells and Breg in the spleen in each

2.4 各組小鼠細胞因子(IL-10、TGF-β、IL-6和IFN-γ)mRNA的水平比較

與對照組比較，DSS組抗炎因子IL-10及TGF-β mRNA水平明顯降低，炎性因子IL-6及IFN-γmRNA水平明顯升高(P<0.05)；與DSS組比較，DSS+DHM組和DSS+mesalazine組抗炎因子水平明顯升高，炎性因子水平明顯降低(P<0.05) (圖4A～D)。

A.IL-10；B.TGF-β；C.IL-6；D.IFN-γ;*P<0.05 compared with normal group; #P<0.05 compared with DSS group圖4 RT-PCR檢測脾臟細胞中細胞因子的mRNA水平Fig 4 The cytokines mRNA level of splenocytes were detected by

2.5 DHM對小鼠脾臟細胞的促增殖作用

體外不同濃度DHM干預脾臟細胞，隨著DHM濃度的階梯式升高，DHM對脾臟細胞具有明顯促增殖作用(如圖5A, B)(P<0.05)。與對照組比較，DHM在體外能顯著促進Breg細胞增殖(P<0.05)(圖5B,C)。

A,B.CCK8 were used to detect the proliferation of splenocytes at different concentrations of DHM at 24 and 48 hours， *P<0.05 compared with 0 μmol/L group; C.flow cytometry was used to detect the effect of DHM on the proliferation of Breg in vitro; D.quantiative analysis,*P<0.05 compared with NC group圖5 體外實驗驗證DHM對脾臟細胞及Breg細胞的作用Fig 5 Effect of DHM on spleen and Breg cells was verified in

3 討論

UC與免疫系統紊亂密切相關，腸道免疫系統在環境因素和腸道菌群的參與下被激活，在持續的抗原刺激和(或)免疫失調的情況下，炎性反應級聯放大，炎性介質導致組織損傷，從而致使UC的發生。目前UC的治療存在藥物低反應、治療效果差、副作用大、禁忌證、經濟負擔重等多種因素使UC成為一個需要終身護理的疾病，嚴重影響國民健康，加重經濟負擔[12-13]。二氫楊梅素是一種傳統中藥，具有抗感染、抗氧化、降血脂、解酒保肝的作用。本課題組前期研究證實，DHM在小鼠實驗性結腸炎中主要通過恢復免疫細胞Treg/Th17之間的平衡，調節腸道微環境，同時降低結腸組織中金屬蛋白酶表達，減少細胞外基質的降解，從而發揮治療作用。本研究通過DSS制備小鼠實驗性結腸炎模型，經DHM治療后發現，DHM能夠明顯改善小鼠結腸炎的癥狀、結腸組織學損傷及DAI評分，且治療組炎性因子水平降低，與前期研究相符[14]。

然而在UC疾病病程中，不僅包括T細胞介導的免疫應答， B細胞也參與了UC的發生發展。目前，除傳統B細胞外，一種獨特的B細胞亞群定義為Breg，具有調節炎性和自身免疫的功能，其特征是產生調節性細胞因子IL-10和TGF-β[9, 15]。CD19+CD5+CD1d+B細胞是B細胞群中能夠分泌IL-10發揮作用的主要亞群，是Breg細胞的特征之一。雖然Bregs只占所有免疫細胞的極小部分，但它們在調節免疫反應方面具有重要的作用[9, 12]。本研究通過DHM治療DSS結腸炎小鼠，檢測脾臟單細胞懸液中CD19+B及Breg(CD19+CD5+CD1d+B)的比例變化，發現DSS組小鼠脾臟Breg比例明顯降低，經DHM治療后，Breg比例明顯增多，抗炎因子IL-10和TGF-β mRNA水平明顯升高，首次在體內實驗中證實DHM治療結腸炎小鼠可能是通過調節Breg細胞數目及其分泌的抗炎細胞因子實現的。同樣，在體外實驗中，使用不同濃度DHM干預小鼠脾臟細胞，發現DHM能明顯促進脾臟細胞的增殖，應用流式細胞術檢測DHM干預脾臟細胞24 h后Breg細胞比例變化，發現與對照組相比，DHM明顯增加了Breg細胞的比例，體內外實驗證實DHM在實驗性結腸炎小鼠中發揮治療作用是通過促進Breg增殖及分泌抗炎因子IL-10和TGF-β有關，但是其上下游的機制尚不明確，需要進一步的研究。