下調lncRNA DNM3OS通過靶向miR-193a-3p增強人直腸癌細胞系SW-480的放療敏感性

劉明勝， 陳文超， 蔡穎暢

(衢州市人民醫院 肛腸外科， 浙江 衢州 324000)

直腸癌(rectal cancer)是常見惡性腫瘤，放射治療是其重要治療手段，聯合手術治療可提高患者總生存率[1]。尋找對新輔助治療有預測性及整體生存有預后性的生物標志物是直腸癌新輔助治療領域的研究熱點[2]。研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與腫瘤的進展有關，研究報道lncRNA DNM3OS在胃癌組織和細胞系中上調，可作為胃癌患者預后不良的指標；抑制DNM3OS可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[3]。DNM3OS可影響口腔癌細胞的活力和遷移[4]。DNM3OS通過調節食管鱗狀細胞癌中的DNA損傷反應而賦予放射抗性[5]。然而DNM3OS在直腸癌中的作用及其是否影響直腸癌SW-480的放射敏感性目前還尚未清楚。生物學在線軟件預測發現DNM3OS與miR-193a-3p有結合位點。研究報道miR-193a-3p在直腸癌患者治療前血漿樣品中顯著下調[6]。miR-193a-3p過表達可抑制結直腸癌細胞HT-29的增殖，遷移[7]。本實驗旨在研究lncRNA DNM3OS對直腸癌細胞的增殖、凋亡及放射敏感性的影響及其機制是否與miR-193a-3p有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本: 2015年6月至2020年6月衢州市人民醫院收治的具有完整臨床病理資料的直腸癌患者30例，全部患者經病理檢查確診，通過手術切除其癌組織和癌旁組織；患者均知情且簽署知情同意書。本實驗經本院倫理委員會審查批準(批準文號：院字0122019)。

1.1.2 細胞與試劑：人直腸癌細胞系SW-480(ATCC)；RPMI-1640完全培養基(Gibco公司)；熒光定量PCR試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(日本同仁研究所)；凋亡檢測試劑盒(艾美捷科技有限公司)；蛋白裂解液(上海源葉生物科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(AAT Bioquest公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組： SW-480細胞用RPMI-1640完全培養基培養，取對數生長期細胞，將DNM3OS干擾表達載體及陰性對照、miR-193a-3p模擬物及陰性對照轉染至SW-480細胞中，記為si-DNM3OS組、si-NC組、miR-193a-3p組、miR-NC組；將DNM3OS干擾表達載體分別與miR-193a-3p抑制劑陰性對照共轉染至SW-480細胞中，記為si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組。si-NC組、si-DNM3OS組、miR-NC組、miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組、si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細胞分別用4 Gy的射線照射后，記為4 Gy+si-NC組、4 Gy+si-DNM3OS組、4 Gy+miR-NC組、4 Gy+miR-193a-3p組、4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組、4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測DNM3OS和miR-193a-3p的表達水平：提取組織和細胞RNA，按試劑盒說明進行PCR，以GAPDH和U6為內參，用2-△△Ct法計算相對表達量。DNM3OS上游引物序列：5′-CAAGGCTCTCACTTGTCCTG-3′，下游引物序列：5′-CAGCTGGAAACTGACCAAAG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CTTCCGTGTTCCTACCC-3′，下游引物序列：5′-ACCTGGTCCTCAGTGTAGCC-3′；miR-193a-3p上游引物序列：5′-AACTGGCCTAC AAAGTCCCAGT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTG TCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGC AGCACATATAC-3′，下游引物序列：5′-AAAATATGG AACGCTTCACGA-3′。

1.2.3 細胞集落形成實驗檢測細胞放射敏感性： si-NC組、si-DNM3OS組、miR-NC組、miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組、si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細胞接種于60 mm的培養皿中，分別給予0、2、4、6、8 Gy的射線照射，照射后繼續培養2周，吉姆薩染色后在光學顯微鏡下計數大于50個細胞的集落。采用GraghPad Prism5擬合細胞存活曲線。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖抑制率： 細胞培養48 h，按試劑盒說明操作，加入MTT溶液和二甲基亞砜，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。增殖抑制率=1-A實驗組值/A空白組值×100%。

1.2.5 流式細胞測量術檢測細胞凋亡： 收集各組細胞，漂洗后按試劑盒說明操作，加入Annexin V-FITC和PI，孵育后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達： 提取各組細胞總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經過轉膜封閉，然后加入一抗在4 ℃的冰箱中過夜；加入二抗室溫孵育2 h，顯影，成像，分析蛋白條帶灰度值。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗：將DNM3OS的野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC和miR-193a-3p共轉染至SW-480細胞中，按說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 lncRNA DNM3OS和miR-193a-3p在直腸癌組織中的表達

直腸癌組織中DNM3OS表達水平高于癌旁組織，miR-193a-3p表達水平低于癌旁組織(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with adjacent tissues圖1 lncRNA DNM3OS和miR-193a-3p在直腸癌組織中的表達Fig 1 Expression of lncRNA DNM3OS and miR-193a-3p

2.2 抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞放射敏感性的影響

與si-NC組比較，si-DNM3OS組DNM3OS表達水平降低(0.39±0.03比1.01±0.04，t=12.225，P<0.05)；不同劑量射線照射后si-DNM3OS組細胞存活分數降低(P<0.05)，其放射增敏比為1.798(圖2)。

*P<0.05 compared with si-NC group圖2 抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞存活分數的影響Fig 2 Effect of inhibiting the expression of lncRNA DNM3OS on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

2.3 抑制lncRNA DNM3OS表達聯合4Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響

si-DNM3OS組SW-480細胞增殖抑制率和凋亡率高于si-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平低于si-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平高于si-NC組(P<0.05)；4 Gy+si-DNM3OS組細胞增殖抑制率和凋亡率高于4 Gy+si-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平低于4 Gy+si-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平高于4 Gy+si-NC組(P<0.05)(圖3)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression; *P<0.05 compared with si-NC group; #P<0.05 compared with 4 Gy+si-NC group圖3 抑制lncRNA DNM3OS表達聯合4 Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響Fig 3 Effect of inhibition of lncRNA DNM3OS expression combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

2.4 lncRNA DNM3OS靶向調控miR-193a-3p的表達

Starbase預測顯示lncRNA DNM3OS與miR-193a-3p有結合位點(圖4A)。WT-DNM3OS與miR-193a-3p共轉染后的SW-480細胞熒光素酶活性低于與miR-NC共轉染的細胞(P<0.05)(圖4B)。過表達DNM3OS，miR-193a-3p表達水平降低；抑制DNM3OS表達，miR-193a-3p表達水平升高(P<0.05)(圖4C)。

A.binding site of lncRNA DNM3OS and miR-193a-3p; B.cellular luciferase activity; C.lncRNA DNM3OS regulates the expression of miR-193a-3p; *P<0.05 compared with miR-NC group; #P<0.05 compared with pcDNA group; ▲P<0.05 compared with si-NC group圖4 lncRNA DNM3OS靶向調控miR-193a-3p的表達Fig 4 lncRNA DNM3OS targeting regulated the expression of

2.5 過表達miR-193a-3p對直腸癌SW-480細胞放射敏感性的影響

與miR-NC組比較，miR-193a-3p組miR-193a-3p表達水平升高(2.85±0.14比1.01±0.04，t=12.601，P<0.05)，不同劑量射線照射后miR-193a-3p組細胞存活分數降低(P<0.05)，細胞放射增敏比為1.701(圖5)。

*P<0.05 compared with miR-NC圖5 過表達miR-193a-3p對直腸癌SW-480細胞存活分數的影響Fig 5 Effect of over-expression of miR-193a-3p on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

2.6 過表達miR-193a-3p聯合4 Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響

miR-193a-3p組細胞增殖抑制率和凋亡率高于miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平低于miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平高于miR-NC組(P<0.05)；4 Gy+miR-193a-3p組細胞增殖抑制率和凋亡率高于4 Gy+miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平低于4 Gy+miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平高于4 Gy+miR-NC組(P<0.05)(圖6)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression; *P<0.05 compared with miR-NC group; #P<0.05 compared with 4 Gy+miR-NC group圖6 過表達miR-193a-3p聯合4 Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響Fig 6 Effect of over-expression miR-193a-3p combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

2.7 干擾miR-193a-3p表達逆轉了抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞放射敏感性的影響

不同劑量照射后si-DNM3OS+anti-miR-NC組細胞存活分數低于si-NC組，放射增敏比為1.745，si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細胞存活分數高于si-DNM3OS+anti-miR-NC組，放射增敏比為1.140；4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細胞增殖抑制率和凋亡率低于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平高于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平低于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組(P<0.05)(圖7，8)。

*P<0.05 compared with 4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC group圖7 干擾miR-193a-3p表達逆轉了抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞存活分數的影響Fig 7 Interfering miR-193a-3p expression reversed the effect of inhibiting lncRNA DNM3OS expression on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

綜上所述，抑制lncRNA DNM3OS表達可抑制SW-480細胞增殖，促進細胞凋亡以及增強細胞的放射敏感性，其機制可能與miR-193a-3p有關。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression;*P<0.05 compared with 4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC group圖8 干擾miR-193a-3p表達逆轉了抑制lncRNA DNM3OS表達聯合4 Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響Fig 8 Interference with miR-193a-3p expression reversed the effect of inhibiting lncRNA DNM3OS expression combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

3 討論

新輔助放療是局部晚期直腸癌的標準治療模式，但不同患者對放療的反應不同，因此，提高患者對其敏感性，對制定個體化的治療策略具有重要意義[8]。研究報道lncRNA DNM3OS可促進視網膜母細胞瘤細胞增殖，遷移[9]。抑制DNM3OS表達可減少卵巢癌細胞遷移和侵襲[10]。本實驗結果顯示，直腸癌組織中DNM3OS表達水平升高，表明DNM3OS可能在直腸癌中起促癌作用。轉染DNM3OS干擾表達載體后，細胞增殖抑制率和凋亡率升高，表明抑制DNM3OS可抑制SW-480細胞的增殖，并促進細胞凋亡。轉染DNM3OS干擾表達載體后并用不同劑量射線照射，結果發現細胞存活分數降低，表明抑制DNM3OS表達提高了癌細胞對放射射線的敏感性。此外，轉染DNM3OS干擾表達載體并用4 Gy的射線照射后細胞增殖抑制率和凋亡率也顯著升高，表明抑制DNM3OS表達的同時用射線照射對SW-480細胞的抑癌作用更強。

研究表明，miRNA也參與調控結直腸癌細胞惡性生物學行為[11]。已有研究表明，miR-193a-3p在直腸癌患者血漿中下調[6]。本實驗結果顯示，直腸癌組織中miR-193a-3p表達水平降低，與前人研究[6]結果相符，提示miR-193a-3p可能在直腸癌中起抑癌作用。此外，研究報道miR-193a-3p可促進鼻咽癌細胞的放射抗性[12]。本實驗結果顯示，單獨過表達miR-193a-3p或用射線照射，SW-480細胞增殖抑制率和凋亡率升高，且不同劑量射線照射后，細胞存活分數降低；表明過表達miR-193a-3p可抑制SW-480細胞增殖，促進細胞凋亡，且可增加細胞的放射敏感性。本實驗還發現，DNM3OS靶向調控miR-193a-3p，干擾miR-193a-3p表達逆轉了抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響。