miR-125靶向SMAD4抑制脂多糖誘導(dǎo)的人結(jié)腸上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化

曾 笛，張聰敏，郭金培，張 楠，馬二民

(1.鄭州市第七人民醫(yī)院 普外科，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 普外科， 河南 鄭州 450000)

腸道菌群通過(guò)分泌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)介導(dǎo)的異常炎性反應(yīng)可能對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[1-2]。正常生理狀態(tài)下，腸道炎性可促進(jìn)組織損傷修復(fù)[3]。但腸道菌群功能失調(diào)時(shí)，菌群釋放過(guò)量LPS，導(dǎo)致腸道炎性反應(yīng)亢進(jìn)，常伴隨結(jié)腸上皮細(xì)胞惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化[4]。microRNA(miRNA)可與靶基因的3′-UTR區(qū)域特異性結(jié)合而影響靶基因的降解或翻譯蛋白產(chǎn)物表達(dá)[5-6]。TGF-β信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，且SMAD4在其介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞功能轉(zhuǎn)換過(guò)程有重要意義。其中miR-125被認(rèn)為是SMAD4結(jié)合的關(guān)鍵miRNA之一，但在LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮炎性微環(huán)境中的作用尚未報(bào)道。因此，本研究擬利用LPS對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行低濃度長(zhǎng)期炎性刺激，探索炎性微環(huán)境在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LPS(上海愛(ài)必信生物科技有限公司)；人結(jié)腸上皮細(xì)胞系HCoEpiCs(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Thermo Fisher公司)；CCK-8試劑盒(南京福麥斯生物科技有限公司)；miR-125 mimic和inhibitor套裝(廣州銳博生物科技有限公司)；SMAD4-3′-UTR野生型和突變型質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因公司)；Lipofectamine3000(Invitrogen公司)氯仿、異丙醇和無(wú)水乙醇(上海滬試試劑有限公司)；Trizol、mRNA反轉(zhuǎn)和定量試劑盒(TaKaRa公司)；miRNA提取、定量試劑盒(北京天根生物科技有限公司)；螢火蟲/海腎底物發(fā)光試劑盒(Promega公司)；4%多聚甲醛(南京邁博生物有限公司)；吉姆薩染色液(廣州泛思生物科技有限公司)；瓊脂(北京索萊寶生物科技有限公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 The sequence of primer pairs

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HCoEpiCs結(jié)腸上皮細(xì)胞。當(dāng)觀察到細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底面匯合達(dá)到80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化細(xì)胞2 min，加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基終止消化，離心后棄上清，重懸并加入到含新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24 h后，以CCK-8法實(shí)驗(yàn)確定的最佳LPS刺激濃度為后續(xù)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的刺激濃度。用培養(yǎng)基將LPS稀釋到最佳刺激終濃度培養(yǎng)HCoEpiCs細(xì)胞并傳代，連續(xù)重復(fù)此細(xì)胞刺激和傳代操作至40代。

以8×104個(gè)/mL的濃度鋪細(xì)胞到6孔板內(nèi)，每個(gè)孔加2 mL的完全培養(yǎng)基，放到培養(yǎng)箱內(nèi)24 h。將miR-125 mimic、inhibitor、mimic-NC和inhibitor-NC(50 nmol/L)用125 μL無(wú)雙抗的DMEM混勻，將5 μL Lipofectamine3000用125 μL無(wú)血清和雙抗的DMEM混勻并靜置5 min。上述兩組液體充分混勻后，室溫下放置15 min后加入6孔板。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性：收集對(duì)數(shù)增值期的細(xì)胞，將5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔培養(yǎng)基體積為200 μL，培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞是否均勻貼壁。分為0(空白對(duì)照組)、5、10和15 μg/mL刺激組，分別加入不同濃度含LPS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK8試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)HCoEpiCs結(jié)腸上皮細(xì)胞mRNA：向6孔板中加入1 mL的RNAiso Plus反應(yīng)5 min并轉(zhuǎn)移到1.5 mL無(wú)酶離心管中。加200 μL氯仿。4 ℃，12 000×g離心15 min，吸取上清到新無(wú)酶離心管內(nèi)。加500 μL異丙醇，室溫放置10 min。4 ℃，12 000×g離心10 min，棄上清。加75%乙醇1 mL，4 ℃、7 500×g離心5 min。離心管倒置10 min后，加無(wú)酶水使離心管內(nèi)沉淀溶解，在核酸蛋白分析儀上測(cè)定RNA濃度。用PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用TB Green試劑盒進(jìn)行熒光定量。反應(yīng)體系為：mix 10 μL,正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，RoxⅡ 0.4 μL及6.8 μL的無(wú)酶水。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。以GAPDH或U6為內(nèi)參，所得數(shù)值采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 平板克隆和軟瓊脂集落檢測(cè)HCoEpiCs結(jié)腸上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化：取LPS刺激后1代、30代和40代對(duì)數(shù)增值期的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后將細(xì)胞重懸在10%完全培養(yǎng)基中。以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度分別均勻接種在6孔板中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。當(dāng)孔中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆細(xì)胞團(tuán)時(shí)，棄去上清液，用PBS清洗3次。每孔加1 mL的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。小心吸去固定液，加200 μL的吉姆薩染色液染20 min，用流水緩慢洗去染色液，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，計(jì)算克隆形成率。

配制1.2%和0.7%的瓊脂，經(jīng)高壓滅菌后，放入42 ℃水浴鍋中，將1.2%瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，每孔1.5 mL鋪入6孔板作為下層，37 ℃孵育30 min使之凝固；將單細(xì)胞懸液與1 mL的0.7%瓊脂充分混勻，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度加入6孔板作為上層膠。凝固后于上層膠上加入200 μL完全培養(yǎng)基，每隔3 d更換一次培養(yǎng)基。10 d后在顯微鏡下觀察克隆大小，并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LPS對(duì)HCoEpiCs細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組相比，當(dāng)LPS刺激濃度為10 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力開(kāi)始受到明顯抑制，其抑制率隨著藥物濃度的遞增而增加(圖1，P<0.05)，選取該濃度為后續(xù)細(xì)胞刺激濃度。

*P<0.05 compared with control group圖1 不同濃度LPS對(duì)HCoEpiCs結(jié)腸上皮細(xì)胞活力的影響Fig 1 Viability of HCoEpiCs cells treated with different concentrations of LPS

2.2 LPS對(duì)HCoEpiCs細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因cyclinD1在刺激40代(P40)后表達(dá)量出現(xiàn)明顯增加(P<0.05)，而癌基因c-myc和抗凋亡基因Bcl-2均在刺激30代后(P30)表達(dá)量出現(xiàn)明顯增加(圖2A) (P<0.05)。平板克隆和軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS刺激后30代未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆，而刺激后40代細(xì)胞形成明顯的克隆(圖2B，C)。

A.expression of cyclinD1,c-myc, and Bcl-2 in the continuously LPS-treated HCoEpiCs cells; B.colony formation of LPS-treated HCoEpiCs cells; C.soft agar colony formation assay of HCoEpiCs cells treated with LPS; *P<0.05 compared with P1; P1,P10,P20,P30,and P40 mean HCoEpiCs cells continually treated with LPS at the 1th,10th,20th,30th,and the 40th passage圖2 LPS連續(xù)刺激對(duì)HCoEpiCs結(jié)腸上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Fig 2 Results of LPS-induced HCoEpiCs cells transformed to cancer cells

2.3 LPS誘導(dǎo)HCoEpiCs細(xì)胞中miR-125和SMAD4的表達(dá)情況

與P1代相比，P40代細(xì)胞中的miR-125表達(dá)出現(xiàn)明顯的增加(P<0.05)，而SMAD4表達(dá)出現(xiàn)明顯的降低(P<0.05)(圖3)。

A.relative expression of miR-125 in the 1th and 40th passage of LPS-induced HCoEpiCs cells; B.the level of SMAD4 in the 1th and 40th passage of LPS-treated HCoEpiCs cells; *P<0.05 compared with P1 group圖3 HCoEpiCs結(jié)腸上皮細(xì)胞中miR-125和SMAD4表達(dá)情況Fig 3 Relative expression of miR-125 and SMAD4 in HCoEpiCs cells

2.4 干預(yù)miR-125對(duì)HCoEpiCs細(xì)胞SMAD4表達(dá)的影響

過(guò)表達(dá)miR-125后SMAD4和癌基因c-myc表達(dá)出現(xiàn)明顯的降低(P<0.05)，而抑制miR-125表達(dá)后SMAD4和c-myc均出現(xiàn)明顯的增高(P<0.05)(圖4)。

A.relative level of SMAD4 in the 40th passage of LPS-treated HCoEpiCs cells who transfected miR-125 mimic or inhibitor; B.expression of c-myc in the 40th passage of LPS-treated HCoEpiCs cells who transfected miR-125 mimic or inhibitor; *P<0.05 compared with mimic-NC group,#P<0.05 compared with inhibitor-NC group圖4 干預(yù)miR-125對(duì)HCoEpiCs細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響Fig 4 Effect on HCoEpiCs cells relative mRNA expression by interfering miR-125

2.5 miR-125靶向SMAD4并抑制該基因表達(dá)

過(guò)表達(dá)miR-125后，SMAD4的野生型3′-UTR相對(duì)熒光素酶活性出現(xiàn)了明顯的下降(P<0.05)；但SMAD4的3′-UTR區(qū)被突變后，相對(duì)熒光素酶活性未出現(xiàn)明顯改變(圖5)。

*P<0.05 compared with control group圖5 HCoEpiCs細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-125 mimic和SMAD43′-UTR后熒光素酶活性Fig 5 Luciferase activities of HCoEpiCs cells who cotransfected with miR-125 mimic and relative SMAD4 3′-UTR

3 討論

正常結(jié)腸細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程常與結(jié)腸上皮損傷、化學(xué)促癌試劑和某些致癌生物毒素等外源性因素相關(guān)[7]，也受患者自身基因突變、生活習(xí)慣和自身免疫等內(nèi)源性因素影響。結(jié)腸上皮細(xì)胞癌變過(guò)程通常存在著許多促癌因素的誘導(dǎo)和多種關(guān)鍵基因的調(diào)控[8]。由于腸道菌群紊亂而導(dǎo)致革蘭陰性菌過(guò)度釋放LPS， 致使腸道處于長(zhǎng)期慢性炎性刺激狀態(tài)[9]，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，觀察LPS對(duì)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，探索該過(guò)程涉及的分子機(jī)制可能對(duì)結(jié)腸癌的防治具有重要意義。

本研究以人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HCoEpiCs為受試對(duì)象，通過(guò)CCK-8法探索了不同濃度LPS對(duì)該細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)LPS刺激濃度為10 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力開(kāi)始出現(xiàn)明顯抑制，且該濃度與參考文獻(xiàn)[10]在肺癌上皮細(xì)胞中的刺激濃度一致，因此選用該濃度為后續(xù)長(zhǎng)期慢性炎性刺激的濃度。LPS對(duì)HCoEpiCs細(xì)胞連續(xù)刺激40代后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期相關(guān)基因cyclinD1、癌基因c-myc和抗凋亡基因Bcl-2均出現(xiàn)明顯的增高，且平板克隆和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞團(tuán)，說(shuō)明LPS可誘導(dǎo)HCoEpiCs細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。已有研究報(bào)道m(xù)iR-125和TGF-β信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)分子SMAD4在肺癌、食管癌和乳腺癌等疾病中存在重要的靶向關(guān)系[11-12]，但在LPS誘導(dǎo)的正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況和作用尚未可知。因此，本研究發(fā)現(xiàn)P40代細(xì)胞中miR-125出現(xiàn)明顯的升高，而SMAD4出現(xiàn)顯著的降低。利用mimic和inhibitor對(duì)miR-125干預(yù)后，SMAD4的表達(dá)均出現(xiàn)明顯的改變，這提示miR-125和SMAD4在LPS誘導(dǎo)的HCoEpiCs向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能存在重要的關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)癌基因c-myc的變化，結(jié)果提示干預(yù)miR-125可能通過(guò)靶向SMAD4對(duì)HCoEpiCs細(xì)胞癌變過(guò)程具有重要影響。隨后的雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證明miR-125和SMAD4之間存在重要的靶向關(guān)系。因此本研究認(rèn)為miR-125可靶向SMAD4進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

本研究的局限性在于未探索沉默SMAD4后對(duì)LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，SMAD4作為TGF-β信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)分子，其在LPS誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中的作用可能與結(jié)腸癌細(xì)胞的作用存在相同的機(jī)制，因此后續(xù)研究應(yīng)重點(diǎn)探索SMAD4在LPS誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中是否具有前期的抑制效應(yīng)及后期的促進(jìn)向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。