RNA結合蛋白PCBP1通過影響mRNA核質穿梭調控hESC多能性

徐嘉悅，楊嘉賓，陳仲揚，余 佳，馬艷妮

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生物化學與分子生物學系醫學分子生物學國家重點實驗室, 北京 100005)

千百年來，人類胚胎發育一直是大家重點關注的話題，隨著科學技術的發展，人們能夠將囊胚期具有多能性和自我更新能力的內細胞團人胚胎干細胞(human embryonic stem cell, hESC)分離出來并進行體外培養[1]，探究hESC維持多能性和自我更新能力的基因表達調控機制可以使其更廣泛快速地應用于臨床治療，促進人類健康事業的發展。

RNA結合蛋白(RNA binding protein，RBP)是一類可以與RNA分子結合的蛋白，近年來對RNA結合蛋白質實驗方法層出不窮，揭示了大量的經典和非經典RBP[2-3]。這些RBP的功能復雜，在轉錄后的RNA代謝過程中發揮著重要的調控功能，其中mRNA核質定位運輸是哺乳動物轉錄后水平調節基因表達潛在的重要節點[3]。

RNA結合蛋白多聚胞嘧啶結合蛋白1[poly(rC) binding protein 1，PCBP1]是一種穿梭蛋白，可通過在細胞核中結合pre-mRNA或ssDNA從而調節轉錄、選擇性剪接過程，及在細胞質中結合mRNA參與翻譯調控過程，以促進或抑制基因的表達[4]。本研究旨在探究PCBP1在hESC維持自我更新中的生物學功能，探討其在RNA核質運輸過程中的新機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞: hESC為H1細胞系(北京協和醫學院血液學研究所贈送)

1.1.2 主要試劑: 構建質粒所需的內切酶(NEB公司)； Matrigel、mTESR1、ReLeSR和Accutase(Stem Cell公司)；堿性磷酸酶染色試劑盒(Millipore公司)；核質分離試劑盒(Thermo Fisher Scientificals公司)；Trizol、反轉錄酶及反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)；RT-qPCR試劑(TaKaRa公司)；PCBP1一抗、β-actin一抗(Proteintech公司); 山羊抗兔二抗(上海碧云天生物有限公司)；引物(天一輝遠測序公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養人胚胎干細胞：提前準備matrigel，將matrigel根據稀釋因子稀釋后鋪至培養皿，4 ℃放置過夜后進行H1 hESC的培養。細胞會呈現克隆狀增殖，大約3～5 d按1∶6的比例進行傳代：用37 ℃的PBS清洗細胞，用ReLeSR消化hESC。加入培養基mTESR1重懸克隆，傳代至6孔板中進行培養。凍存：與傳代消化方法一致，用F12培養基重懸并進行1 000 r/min離心，用mFresR凍存液進行凍存。收細胞進行細胞實驗時用accutase進行消化收集。

1.2.2 構建PCBP1的 shRNA載體：在NCBI網站找到PCBP1 mRNA序列，在專業設計網站上設計1條特異性結合PCBP1 mRNA的shRNA序列，在shRNA序列兩端加入EcoR1/Age1酶切位點的黏性末端序列，合成的兩條shRNA單鏈片段95 ℃高溫退火，得到的雙鏈片段與已切好的pLKO.1載體連接，轉化后挑菌提質粒，進行病毒包裝。

1.2.3 包裝慢病毒：用人胚胎腎細胞HEK293包裝病毒，取6 μg目的質粒，4.5 μg PXPAX2和1.5 μg PMD2G包裝質粒用opt-mem無血清培養基預混，加入12 μL包裝試劑neofect 混勻后室溫反應30 min，滴入293T細胞中，4 ～ 6 h換培養基，48 h后收病毒。

1.2.4 hESC堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色：6孔板每孔1×103個單細胞，培養7 d，使用試劑盒進行染色。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白質表達情況:提取細胞總蛋白后進行蛋白定量，高溫變性后取等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳, 電轉2 h,室溫封閉0.5～1 h，一抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜30 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學發光顯影儀顯影。

1.2.6 分離細胞核和細胞質：收取20 μL體積的hESC，PBS洗一次后使用核質分離試劑盒分離hESC核質組分。

1.2.7 RNA提取及實時熒光定量PCR(RT-qPCR): 用Trizol提RNA，加入氯仿后劇烈震蕩，12 000 r/min離心，沉淀用75%乙醇清洗，晾干后用ddH2O復溶，測濃度。配置反轉錄體系，檢測總體積為20 μL。隨后進行qPCR進行 45個循環的擴增。RT-qPCR用到的引物見表1。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 抑制內源PCBP1的表達影響了hESC克隆形成能力和多能性

設計一條shRNA在hESC細胞中顯著抑制PCBP1的表達， PCBP1 shRNA敲低效率大于50% (圖1A)。由于PCBP1在hESC分化過程中表達水平降低，因此檢測PCBP1在hESC多能性維持中的功能。一方面，抑制PCBP1的表達導致hESC細胞克隆出現分化和死亡形態，同時進行克隆數量統計發現克隆數量顯著減少，堿性磷酸酶染色顯示PCBP1蛋白敲低導致細胞分化(P<0.01)(圖1B)。另一方面，抑制PCBP1的表達在RNA水平上抑制了多能性標志基因的表達，促進了各胚層分化標志基因的表達 (圖1C)。兩方面證據體現了敲低PCBP1蛋白抑制了hESC多能性。

A.Western blot was used to detect the knock down efficiency of PCBP1 protein; B.cell clone morphology was observed under microscope and stained with alkaline phosphatase, alkaline phosphatase staining showed the formation of clones and made statistics, *P<0.01 compared with shNC; C.expression changes of pluripotent marker genes (OCT4, SOX2),differentiation marker genes (HAND1, GATA2, Brachyury, GATA3) were detected by qPCR；*P<0.01， **P<0.001 compared with shNC group圖1 PCBP1對hESC多能性維持的影響Fig 1 Effect of PCBP1 on the maintenance of hESC n>3)

2.2 PCBP1在hESC中顯著調控RNA核質定位

利用在hESC細胞中構建的shRNA抑制PCBP1蛋白表達后分離 hESC細胞核與細胞質，可見對照組和實驗組細胞核標志RNA pre-GAPDH和45S rRNA主要定位在細胞核中(P<0.001)，細胞質標志RNA GAPDH和β-actin主要定位在細胞核中(P<0.001)(圖2A，B)，在核質分離成功的情況下，提取各細胞組分的RNA進行RNA測序。獲得結果后進行數據標準化，計算RNA核質信號分布，發現敲低PCBP1后，有242條RNA核滯留，有1 272條RNA出核促進(圖2C)，可見PCBP1顯著調控RNA細胞核定位。根據RNA在核質的豐度，將敲低PCBP1之后差異定位的RNA分群并用熱圖進行展示(圖2D), 細胞核內富集的RNA分為3類：1)對照組細胞質中多，敲低組細胞核中多; 2)對照組細胞核中多，敲低組細胞核中更多; 3)對照組沒有變化，敲低組細胞核中多。細胞質內富集的RNA分為3類：1)對照組細胞質中多，敲低組細胞質中更多; 2)對照組細胞核中多，敲低組細胞質中多; 3)對照組沒有變化，敲低組細胞質中多。

A,B.nuclear marker RNA pre-GAPDH and 45S rRNA were mainly located in the nucleus, while cytoplasmic marker RNA GAPDH and β-actin were mainly located in the cytoplasm, *P<0.01, **P<0.001 compared with cytoplasm; A.quality control of nucleo-cytoplasmic separation in the control group; B.quality control of nucleo-cytoplasmic separation after the knockdown of HNRNPA3; C.nucleo-cytoplasmic distribution of RNA after knockdown PCBP1; D.differentially located RNA clusters were displayed by heat map圖2 RNA結合蛋白PCBP1對RNA核質定位的影響Fig 2 Effect of RNA binding protein PCBP1 on nucleoplasmic localization of RNA

2.3 PCBP1調控核定位、細胞質定位的RNA類型

對敲低PCBP1后進行核質分離的RNA-seq數據進一步分析，發現PCBP1敲低后核滯留的RNA中，有182條是蛋白編碼基因RNA，有42條是非編碼RNA(圖3A)。其中非編碼RNA主要包含了12種非編碼RNA，其中長基因間非編碼RNA、加工后的假基因和未進行加工的假基因數量最多(圖3B)。在PCBP1敲低后出核促進的RNA中，有1 224條是蛋白編碼基因RNA，有48條是非編碼RNA(圖3C)，其中非編碼RNA主要包含了12種非編碼RNA，其中長基因間非編碼RNA、反義RNA和加工后的假基因數量最多(圖3D)。

A.the type and proportion of RNA retained in the nucleus after PCBP1 knockdown; B.the type and proportion of non-coding RNA retained in the nucleus after PCBP1 knockdown; C.the type and proportion of RNA enriched in cytoplasm after PCBP1 knockdown; D.types and proportions of non-coding RNA enriched in cytoplasm after PCBP1 knockdown圖3 PCBP1調控核定位、細胞質定位的RNA類型Fig 3 PCBP1 regulates nuclear localization and cytoplasmic localization of RNA types

2.4 PCBP1對胚胎發育相關基因的核質定位的影響

敲低PCBP1后RNA-seq檢測到OCT4、SOX2、NANOG多能性mRNA核滯留，分化相關mRNA 只有HAND1出核促進(圖4A)，對敲低PCBP1后核質分離的RNA-seq數據進行差異基因的GO富集分析，發現很多早期胚胎發育相關基因mRNA在PCBP1蛋白敲低后出現核滯留，如：生長發育、脊索動物的胚胎發育、細胞形態發生相關調控基因(圖4B)。而在PCBP1蛋白敲低后出核促進的mRNA主要參與RNA代謝、核糖核蛋白復雜裝配、線粒體運輸、蛋白質的定位、mRNA剪接、負調控蛋白修飾等生物學過程(圖4C)。

A.changes in the distribution of pluripotency and differentiation related genes after knockdown of PCBP1, *P<0.05 compared with shNC group; B.go enrichment analysis of nuclear stranded RNA after PCBP1 protein knockdown; C.go enrichment analysis of cytoplasmic enriched RNA after PCBP1 protein knockdown圖4 核質分布差異基因的GO富集分析Fig 4 A association between hnRNPA3 and the RNA export factors

3 討論

本研究表明，PCBP1對hESC克隆形成能力及多能性維持有重要的作用，敲低PCBP1蛋白引起hESC分化且克隆形成能力下降。對其進行機制的探索，本文發現一方面，PCBP1通過促進多能性基因OCT4、SOX2mRNA的表達，同時抑制分化標志基因HAND1,GATA2,Brachyury和GATA3mRNA水平的表達來維持hESC存活及自我更新能力；另一方面，PCBP1通過調控胚胎發育及干細胞分化相關基因的核質運輸來維持hESC多能性，抑制PCBP1內源性表達后多能性mRNA出核受阻，許多胚胎發育及干細胞分化相關基因mRNA均滯留在細胞核內，只有分化相關mRNAHAND1出核促進。在已知報道中PCBP1定位于細胞核，PCBP1可能通過調控多能性和分化相關mRNA轉錄和出核來發揮功能，從而導致hESC存活能力下降，克隆形成能力減弱。另一種可能是PCBP1調控出核和RNA的穩定性，使滯留在細胞核內的多能性mRNA穩定性下降，不能進入細胞質內進行翻譯。相似的，在之前的報道中，PCBP1KO鼠在囊胚期(3.5E)、胚胎期(8.5E)及出生一周后幼崽存活率依次降低，PCBP1全身性敲除導致胚胎致死[7-8]， PCBP1可能對人和鼠早期胚胎發育和胚胎干細胞的多能性維持有保守性的功能。

核質分離的RNA-seq數據顯示PCBP1主要影響mRNA的核質運輸，對非編碼RNA的核質定位影響不大，一個可能的原因是ncRNA數量上要遠遠少于mRNA。PCBP1對于mRNA出核的調控主要表現在抑制細胞核內的mRNA出核，可能參與了這些mRNA在細胞核內的剪接、加工及穩定性的維持，這與先見知識一致[4]。 PCBP1對于mRNA出核的調控的另一個體現在其幫助許多胚胎發育及分化相關基因的mRNA出核到細胞質中進行翻譯或者是降解。隨著科學技術的進步，人們逐漸發現非編碼RNA在基因表達調控過程中也發揮著舉足輕重的作用[10-11]， PCBP1也會影響少部分非編碼RNA的核質定位。PCBP1在何時何地，以何種方式結合這些潛在功能型非編碼RNA仍然值得繼續更深入地探索。