反相高效液相色譜法測定枯草菌肽的含量及純度

楊彩霞 吳金梅 何濤

摘要 [目的]建立枯草菌肽含量及純度的反相高效液相色譜（RP-HPLC）檢測方法。[方法]采用ZORBAX 300SB-C 8（4.6 mm×150 mm，5 μm），以三氟乙酸-水（1∶1 000）為流動相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）為流動相B;柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，線性梯度洗脫。[結果]在室溫條件下，枯草菌肽溶液12 h內穩定，RSD為0.61%;枯草菌肽主峰保留時間和峰面積的RSD分別為0.18%和0.22%，不同實驗員間的 RSD為0.92%;枯草菌肽的定量限（LOQ）為120 ng、檢出限（LOD）為80 ng，在0.031 25～2.000 00 mg/mL線性關系良好（R2=1）;平均回收率為101.49%（n=9），RSD為0.29%;改變柱溫、流速和色譜柱批號，枯草菌肽理論塔板數均大于2 000，分離度均大于1.5，相對保留時間（RRT）偏差絕對值均不大于20%。測定3批枯草菌肽含量分別為98.8%、99.8% 和 100.2%;純度均大于99%。[結論]該研究建立的檢測方法靈敏、準確、專屬性強，符合定量檢測枯草菌肽含量和純度的要求，適用于枯草菌肽的質量控制。

關鍵詞 枯草菌肽;反相高效液相色譜法;含量;純度;定量檢測

中圖分類號 R 927.2文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）02-0206-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.056

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of the Content and Purity of Sublancin by Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography

YANG Cai-xia1，2，WU Jin-mei3，HE Tao1，2 （1.Sinagri Yingtai Linzhou Biotechnology Park Co.，Ltd.，Anyang，Henan 456550;2.Beijing Sinagri Yingtai Biological Technology Institute Co.，Ltd.，Beijing 100193;3.Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract [Objective] To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） method for detecting the content and purity of sublancin.[Method]Chromatography was performed on ZORBAX 300SB-C 8 chormagraphic column （4.6 mm×150 mm，5 μm），using trifluoroacetic acid-water （1∶1 000） as mobile phase A，using trifluoroacetic acid-water-acetonitrile （0.85∶200∶800）as mobile phase B;the column temperature was 25 ℃，the detection wavelength was 280 nm，the flow rate was 1.0 mL/min，the injection volume was 20 μL，linear gradient elution.[Result]At room temperature，the sublancin solution was stable within 12 hours，and the RSD was 0.61%.The RSD of the main peak retention time and peak area of subtilisin were 0.18% and 0.22%，respectively，and the RSD between different experimenters was 0.92%.The limit of quantification （LOQ） of sublancin was 120 ng，the limit of detection （LOD） was 80 ng，and the linear relationship was good between 0.031 25 and 2.000 00 mg/mL （R2=1）.The average recovery rate was 101.49% （n=9），and the RSD was 0.29%.Changed the column temperature，flow rate and chromatographic column batch number，the theoretical plate numbers of sublancin were all greater than 2 000，the degree of separation was greater than 1.5，and the absolute deviation of the relative retention time （RRT） was less than 20%.The content of three batches of sublancin were 98.8%，99.8% and 100.2%，respectively，with purity greater than 99%.[Conclusion]The detection method established in this study is sensitive，accurate and highly specific，which meets the requirements for quantitative detection of sublancin content and purity，and is suitable for quality control of sublancin.

Key words Sublancin;RP-HPLC;Content;Purity;Quantitative detection

作者簡介 楊彩霞（1987—），女，河南商丘人，獸醫師，碩士，從事新獸藥研發與注冊申報工作。

收稿日期 2021-05-26

在畜禽生產中，抗生素被廣泛用作疾病的預防、治療和促進生長[1]。但隨著抗生素的大量使用甚至濫用，耐藥性和藥物殘留問題日益嚴峻[2]，不僅導致生產動物的抗感染治療難度加大，而且導致其免疫力低下，由此引起生產動物的疫病發病率高，死亡率高。因此，開發抗生素替代產品，尤其是增強生產動物免疫力的藥物，用于畜牧養殖業是亟需解決的任務[3]。

枯草菌肽是由枯草芽孢桿菌產生的含有37個氨基酸的生物多肽，其理化性質極其穩定[4-5]，具有改善動物腸道健康、提高機體免疫力和生長性能的功能[1，3，6-12]，在畜牧行業上有著巨大的應用前景。目前，在國內外，中農穎泰林州生物科園有限公司是唯一一家實現枯草菌肽產業化生產的單位，為了更好地對枯草菌肽相關產品進行質量控制，通過查閱相關文獻[4，13-14]及大量試驗，該研究建立了枯草菌肽的反相高效液相色譜（RP-HPLC）檢測方法，可快速準確地檢測枯草菌肽的含量及純度。

1 材料與方法

1.1 材料

高效液相色譜儀（Agilent1260），購自安捷倫科技（中國）有限公司;色譜柱（ZORBAX 300SB-C 8，4.6 mm×150 mm，5 μm），購自安捷倫科技（中國）有限公司;乙腈（色譜級）、三氟乙酸（色譜級）、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫均購自國藥集團;枯草菌肽對照品（批號20141001，以干燥品計算，含量97.63%），由中農穎泰林州生物科園有限公司提供;枯草菌肽凍干粉原料3批（批號2016111601、2016112101、2016112601），由中農穎泰林州生物科園有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制。

1.2.1.1 供試品溶液。精密稱量枯草菌肽凍干粉適量，用超純水溶解稀釋，再轉移至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，即得。

1.2.1.2 對照品溶液。

精密稱量枯草菌肽對照品10.24 mg（相當于枯草菌肽10.00 mg），用超純水溶解稀釋，再轉移至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，即得1 mg/mL的對照品溶液。

1.2.2 枯草菌肽含量檢測方法的建立。

1.2.2.1 色譜條件。用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以三氟乙酸-水（1∶1 000）為流動相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）為流動相B;柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0mL/min，進樣量20 μL，按表1進行梯度洗脫。理論板數按枯草菌肽峰計算不低于2 000。

1.2.2.2 系統適用性試驗。取“1.2.1.2”對照品溶液作為系統適用性溶液，依“1.2.2.1”色譜條件進行測定，對應理論板數、分離度、拖尾因子和峰面積4個參數分別連續進樣5次。

1.2.2.3 方法專屬性。考察枯草菌肽經過酸破壞、堿破壞、氧化破壞和熱破壞處理后，主要破壞產物與枯草菌肽主峰的分離度，處理情況如下：①對照品，取“1.2.1.2”對照品溶液;②酸破壞，在對照品溶液中按1∶1比例加入0.1 mol/mL的鹽酸溶液，室溫酸破壞1 h; ③堿破壞，在對照品溶液中按1∶1比例加入0.05 mol/mL的氫氧化鈉溶液，室溫堿破壞15 min;④氧化破壞，在對照品溶液中按1∶1比例加入20%的過氧化氫溶液，室溫氧化破壞1 h;⑤熱破壞，取1 mL對照品溶液，水浴80 ℃加熱15 min。

1.2.2.4 樣品穩定性試驗。

取供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h 取樣，依“1.2.2.1”色譜條件進行測定，

計算枯草菌肽主峰峰面積的RSD，考察枯草菌肽溶液在室溫12 h內的降解情況。

1.2.2.5 方法學考察。

（1）靈敏度。采用逐步稀釋的方法，按信噪比S/N≥3和S/N≥10計算檢出限和定量限。

（2）重復性。取供試品，按“1.2.1.1”方法制備樣品6份，依“1.2.2.1”色譜條件進行測定，計算枯草菌肽主峰保留時間和峰面積的RSD，考察重復性。

（3）中間精密度。取供試品，按“1.2.1.1”方法分2個實驗員每人制備樣品6份，依“1.2.2.1”色譜條件進行測定，計算枯草菌肽峰面積的RSD，考察中間精密度。

（4）準確度。按“1.2.1.2”方法配制0.8、1.0、1.2 mg/mL 3個不同濃度的對照品溶液作為準確度溶液，每個濃度的準確度溶液配制3份，每份樣品測定2次，共測定18次，通過計算回收率考察準確度。

（5）線性關系。將枯草菌肽對照品制備成不同濃度的工作溶液，濃度分別為2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，依“1.2.2.1”色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標、主峰峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程及相關系數。

（6）耐用性。取“1.2.1.2”對照品溶液作為耐用性溶液，改變柱溫、流速和色譜柱批號，按“1.2.2.1”項下梯度洗脫程序進行檢測，記錄枯草菌肽理論塔板數、分離度大于1.5和相對保留時間（RRT）偏差絕對值，考察耐用性。

1.2.2.6 含量測定。取3批枯草菌肽凍干粉，按“1.2.1.1”方法制備樣品，質量濃度為1 mg/mL，每批2份，取“1.2.1.2”對照品溶液作為對照溶液，按“1.2.2.1”色譜條件進行測定，記錄色譜圖，采用外標法[15]，以峰面積計算各樣品的含量。

1.2.2.7 雜質測定。取3批枯草菌肽凍干粉，按“1.2.1.1”方法制備樣品，每批2份，質量濃度為2 mg/mL，作為雜質測定用供試品溶液。各精密量取2 mL，分別置于100 mL容量瓶中，超純水定容至刻度，搖勻，制得供試品溶液的2.0%濃度的溶液作為對照溶液。雜質測定用供試品溶液和對照溶液，按“1.2.2.1”色譜條件進行測定，每個樣品測定3次，記錄色譜圖，供試品中主成分與雜質峰分離度大于1.5，主要雜質峰、總雜質峰及對照溶液峰面積RSD均小于5%，按不加校正因子的主成分自身對照法[15]計算雜質含量。

2 結果與分析

2.1 系統適用性 結果如表2所示，枯草菌肽理論板數為10 441，RSD為0.94%;分離度為2.99，RSD為0.49%;拖尾因子為2.13，RSD為2.11%;峰面積為1 891.1，RSD為0.09%，該方法系統適用性良好。

2.2 方法專屬性 將枯草菌肽經過酸破壞、堿破壞、氧化破壞和熱破壞處理后的溶液，按“1.2.2.1”色譜條件進行測定。結果表明（圖1），該色譜條件下，枯草菌肽保留時間約9 min;空白對照不干擾枯草菌肽的含量測定。枯草菌肽在酸性降解條件和加熱降解條件下比較穩定;在堿性降解條件下，主要在9.39 min出現含量約占11.5% 和在10.68 min出現含量約占31.9% 的2個較大破壞產物;在氧化降解中主要在8.7 min出現含量約占19.1% 和在9.2 min出現含量約占2.0% 的2個較大破壞產物;主要破壞產物和枯草菌肽主峰都可以有效地分開，說明該方法的專屬性良好。

2.3 樣品穩定性 按“1.2.2.4”方法操作，計算出枯草菌肽主峰峰面積的RSD為0.61%，主峰無明顯降解。表明供試品溶液12 h內穩定。

2.4 方法學考察

2.4.1 靈敏度。采用逐步稀釋法，取“1.2.1.2”對照品溶液，精密稀釋制樣，稀釋至濃度為0.040、0.008、0.006、0.005、0.004、0.003 mg/mL，依“1.2.2.1”色譜條件進行測定。當枯草菌肽濃度為0.006 mg/mL，進樣量20 μL，信噪比S/N約為10，定量限為120 ng;枯草菌肽濃度為0.004 mg/mL，進樣量20 μL，信噪比S/N約為3，檢出限為80 ng。

2.4.2 重復性。

按“1.2.2.5”中方法操作，計算出枯草菌肽主峰保留時間和峰面積的RSD分別為0.18%和 0.22%，表明重復性良好。

2.4.3 中間精密度。

按“1.2.2.5”中方法操作，計算出枯草菌肽峰面積的RSD為 0.92%，表明不同實驗員間的中間精密度良好。

2.4.4 準確度。

以對照品溶液濃度為100%，配制80%、100%和120%濃度的準確度溶液。即按“1.2.2.5”中方法操作，按“1.2.2.1”色譜條件進行測定，色譜峰面積用標準曲線計算，得各溶液中枯草菌肽的量，求得平均回收率（n=9）為101.49%，RSD為 0.29%。結果見表3。

2.4.5 線性關系。按“1.2.2.5”中方法操作，以濃度為橫坐標、主峰峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為y=1 835.3x-16.146（R2=1），表明在0.031 25～2.000 00 mg/mL，枯草菌肽濃度與峰面積線性關系良好。

2.4.6 耐用性。

按“1.2.2.5”中方法操作，記錄色譜圖，結果顯示（表4），枯草菌肽理論塔板數均大于2 000，分離度均大于1.5，相對保留時間（RRT）偏差絕對值均不大于20%，表明此方法耐用性良好。

2.5 含量測定 按“1.2.2.6”方法操作，結果見表5。3批枯草菌肽的平均含量分別為98.8%、99.8%和100.2%。

2.6 雜質測定 按“1.2.2.7”方法操作，結果見表6。3批枯草菌肽凍干粉原料單雜質均小于0.5%，總雜質均小于1.0%，純度均大于99%。

3 討論

3.1 流動相的選擇 在枯草菌肽的純化及相關試驗過程中，發現該多肽易溶于水，而在反相色譜分離多肽和蛋白質的試驗中，使用三氟乙酸作為離子對試劑是常見的手段，可以改善峰型、克服峰寬和拖尾問題[16-18]。故經過對流動相的配比進行反復摸索，選用以三氟乙酸-水（1∶1 000）為流動相A，以三氟乙酸-水-乙腈（0.85∶200∶800）為流動相B能夠滿足對枯草菌肽含量和純度的分析。

3.2 檢測波長的選擇 將枯草菌肽溶解在超純水中，按照紫外-可見分光光度法（《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部通則0401）[15]測定，在280 nm波長處有最大吸收。

3.3 雜質測定 枯草菌肽為枯草芽孢桿菌發酵產物，在反相色譜中無法明確每一微量雜質具體為何種物質，故而無法獲得各雜質的校正因子，因此在用反相高效液相色譜法測定雜質含量時，使用《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部通則0512）[15]色譜法中的不加校正因子的主成分自身對照法，計算雜質含量。

3.4 對照品的標定 該研究所用的枯草菌肽對照品為中農穎泰林州生物科園有限公司自行制備，目前國內外也尚無同類標準品。依據《9901國家藥品標準物質制備指導原則》（《中國藥典》2015版第四部，通則）[19]，枯草菌肽對照品的賦值采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）和全柱成像毛細管等電聚焦電泳法（WCID-cIEF）2種不同的原理檢測純度，再依據質量平衡法，分別計算含量。質量平衡法計算枯草菌肽對照品含量的公式：①以干燥品計算，對照品含量（%）=〔100%-熾灼殘渣（%）〕×純度（%）;②以濕品計算，對照品含量（%）=〔100%-干燥失重（%）-熾灼殘渣（%）〕×純度（%）。

4 結論

該研究建立的反相高效液相色譜定量檢測枯草菌肽的方法，準確度好，精密度高，重復性穩定，可用于枯草菌肽的純度分析和定量檢測，并為完善及提高枯草菌肽原料及相關產品的質量標準提供了一定的實踐基礎和科學依據。

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