HPLC-MS/MS法測定不同產地千里光中千里光菲靈堿的含量

張石宇 唐成林 林昶 宋信莉 劉英 張恩 石洪州 丁秦

摘要 [目的]測定不同產地11批千里光中千里光菲靈堿的含量。[方法]采用高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS/MS）法進行檢測。色譜柱為ACE Excel 3 C 18-PFP （4.6 mm×150 mm，3 μm），流動相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脫;柱溫40 ℃，流速0.6mL/min;質譜采用電噴霧（ESI）離子源，正離子模式，多反應監測（MRM）的掃描方式進行檢測。[結果]該方法線性關系良好，精密度、重復性和穩定性良好，加樣回收率在96.90%～102.13%，RSD為1.16%～1.48%，該方法符合方法學考察要求;11批千里光藥材中千里光菲靈堿含量為0.069 6～0.811 1 μg/g。[結論]該研究建立的方法穩定可行，可用于千里光中千里光菲靈堿含量的測定，為中藥千里光的質量控制提供新參考。

關鍵詞 千里光;千里光菲靈堿;HPLC-MS/MS;不同產地;含量測定

中圖分類號 R 284.1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）02-0202-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.055

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of Seneciphylline in Senecio scandens from Different Origins Based on HPLC-MS/MS

ZHANG Shi-yu1，TANG Cheng-lin2，LIN Chang3，4 et al （1.The First Affiliated Hospital of Guizhou University of TCM，Guiyang，Guizhou 550001; 2.Guizhou General Station of Crop Technology Extension，Guiyang，Guizhou 550001; 3.College of Pharmacy，Guizhou University of TCM，Guiyang，Guizhou 5500253;4.Research Center of TCM under Forest of Guizhou University of TCM，Guiyang，Guizhou 550025）

Abstract [Objective]To determine the seneciphylline content in 11 batches of Senecio scandens from different origins.[Method]The method of high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS/MS） was used for detection.Ace excel 3 C 18-PFP （4.6 mm×150 mm，3 μm） was used as the chromatographic column，and the mobile phase was 0.1% formic acid acetonitrile -0.1% formic acid water with gradient elution.Column temperature 40 ℃，flow rate 0.6mL/min.Mass spectrometry was detected by electrospray ionization （ESI），positive ion mode and multiple reaction monitoring （MRM）.[Result]The method had good linear relationship，precision，repeatability and stability，and the recovery rate was 96.90%-102.13%，RSD was 1.16%-1.48%，which met the requirements of methodological investigation.The content of seneciphylline in 11 batches of Senecio scandens was 0.069 6-0.811 1 μg/g.[Conclusion]The method established in this study is stable and feasible，and can be used for the determination of seneciphylline content in Senecio scandens，providing a new reference for the quality control of Senecio scandens.

Key words Senecio scandens;Seneciphylline; HPLC-MS/MS; Different origins; Content determination

基金項目 貴州省農業農村廳項目“中藥材生產技術標準制定”（XATH（GZ）2020/042號）;貴州省教育廳青年科技人才成長項目（黔教合KY字〔2022〕259號）;貴州省特色功能食品與中藥制劑開發攻關大平臺（黔教合KY字〔2020〕006）。

作者簡介 張石宇（1987—），女，貴州遵義人，主管中藥師，碩士，從事中藥毒理與藥物代謝研究。*通信作者，農藝師，碩士，從事中藥材規范化種植技術及推廣方面的研究。

收稿日期 2021-05-26;修回日期 2021-07-02

千里光為菊科植物千里光（Senecio scandens Buch.-Ham.）的干燥地上部分[1]。千里光原名千里及，別名九里明、九龍光、黃花草、九嶺光、蒲兒根、一掃光等，始載于《本草拾遺》，主要分布于我國華東、中南及西南各地，常見于山地林邊、灌木草叢和路邊，夏秋采收，是應用歷史悠久的常用中藥之一[2]。千里光具有清熱解毒、明目、利濕的功效，常用于治療癰腫瘡毒、感冒發熱、目赤腫痛、泄瀉痢疾、皮膚濕疹等。近年來研究發現，千里光中含有多種肝毒性吡咯里西啶生物堿（PAs），包括阿多尼弗林堿、千里光堿、千里光菲靈堿、克氏千里光堿等[3-5]。PAs可通過傳統草藥、茶劑、谷物或奶制品、肉類等食物鏈的傳遞被人類攝食，經肝臟細胞色素P450酶代謝活化形成親電性中間體后，與體內生物大分子如蛋白質結合，形成吡咯蛋白加合物（pyrrole-protein adducts，PPA），與體內DNA結合，形成吡咯DNA加合物（pyrrole-DNA adducts，PDA），進而誘導肝臟肝竇阻塞綜合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome，HSOS），致嚴重的肝毒性[6-7]。此外，PAs還具有顯著的肺臟毒性、遺傳毒性、神經毒性和胚胎毒性等[8-9]。因此含PAs的中藥一直是世界衛生組織（WHO）等國際組織及國家嚴密監控的對象。

2020年版《中國藥典》規定了千里光藥材中阿多尼弗林堿的含量限度，不得超過0.004%[1]，然而對其他吡咯里西啶生物堿類均未作規定。千里光菲靈堿是千里光中的主要吡咯里西啶類生物堿之一，有研究報道，額河千里光中千里光菲靈堿的含量為0.055 7%，超過了千里光堿和全緣千里光堿在額河千里光中的含量[10]。千里光菲靈堿是一種具有十二元大環二酯-倒千里光堿類型的PAs，屬于最具肝毒性的PAs[7]。Hincks等[11]研究表明，與其他PAs相比，千里光菲靈堿可以在體外產生更多的PDA。韓佳寅等[12]研究表明，千里光菲靈堿濃度在12.5 ～100 μg/mL時，可在體外致小鼠胚胎毒性。Wang等[13]報道，千里光菲靈堿濃度為5～50 μmol/L時，可通過激活線粒體介導的小鼠和原代肝細胞凋亡誘導其肝毒性。很多研究表明，千里光菲靈堿毒性比其他PAs更大[14-16]。因此，筆者建立了千里光中千里光菲靈堿的含量測定方法，對來源不同產地的11批千里光藥材進行分析與比較，以明確其安全性，為其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。FW100型高速粉碎機（泰斯特儀器有限公司）;SB-5200DT型超聲機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;QL-901型渦旋混合器（江蘇海門市麒麟醫用儀器廠）;AE240型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;美國AB 5500 Q TRAP 質譜儀（Applied Biosystems公司）。

1.1.2 藥品與試劑。千里光菲靈堿（純度≥99%，成都德斯特生物技術有限公司，批號DST200910-125）;乙腈、甲醇和甲酸（質譜級別，德國Merck公司）;水為娃哈哈純凈水。

1.1.3 藥材。試驗用藥材為來自11個產地的千里光樣品，經貴州中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室孫慶文教授鑒定為菊科植物千里光（Senecio scandens Buch.-Ham.）的干燥地上部分。各樣品來源及編號詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備。

1.2.1.1 對照品溶液的制備。取千里光菲靈堿對照品適量，精密稱定，加0.5%甲酸溶液配制成每l mL含0.1 μg的溶液，即得千里光菲靈堿的對照品溶液，4 ℃保存備用。

1.2.1.2 供試品溶液的制備。分別取11批千里光藥材的粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.5%甲酸溶液25mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用0.5%甲酸溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，經0.25 μm微孔濾膜過濾，續濾液即為供試品溶液。

1.2.2 液質聯用條件。

1.2.2.1 色譜條件。色譜柱為ACE Excel 3 C 18-PFP（4.6 mm×150 mm，3 μm）;流速0.6mL/min;柱溫40 ℃;進樣量 20 μL;流動相為0.1%甲酸乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），梯度洗脫（0～2 min，5%～5%B;2～6 min，5%～90%B;6～8 min，90%～90%B;8～9 min，90%～5%B;9～11 min，5%～5%B）。

1.2.2.2 質譜條件。離子源為ESI源;檢測模式為正離子模式;噴霧電壓5 500 V;碰撞氣為N 2;霧化溫度550 ℃;霧化氣379.2 kPa;輔助氣379.2 kPa;去簇電壓70 eV;碰撞電壓38 eV;射入電壓10 eV，掃描方式為多反應檢測（MRM）。為了得到千里光菲靈堿的結構信息，該研究采用Q-Trap質譜上的IDA（information-dependent acquisition）標準觸發的EPI（enhanced product ion）掃描對目標化合物進行二級碎片分析。EPI掃描選擇在正離子模式下，掃描范圍為m/z 50～400。

1.2.3 方法學考察。

1.2.3.1 系統適應性試驗。分別吸取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液各20 μL，在“1.2.2”液質聯用條件下進行測定，記錄色譜圖，考察系統適應性。

1.2.3.2 標準曲線的繪制。分別精密吸取千里光菲靈堿對照品溶液適量，用0.5%甲酸稀釋成質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0和1 000.0 ng/mL的系列對照品溶液。吸取各對照品溶液20 μL，按“1.2.2”液質聯用條件分別進樣分析。以質量濃度（ng/mL）為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3.3 精密度試驗。精密吸取20 ng/mL千里光菲靈堿對照品溶液20 μL，按“1.2.2”液質聯用條件連續進樣6次，測定千里光菲靈堿的峰面積，計算其RSD值。

1.2.3.4 重復性試驗。取同一批號千里光藥材粉末，按“1.2.1.2”方法分別制備6份供試品溶液，按“1.2.2”液質聯用條件進樣分析，測定千里光菲靈堿的含量，計算其RSD值。

1.2.3.5 穩定性試驗。取同一批浙江千里光藥材粉末，按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“1.2.2”液質聯用條件進樣分析，測定千里光菲靈堿的含量，計算其RSD值。

1.2.3.6 加樣回收率試驗。分別稱取已測定含量的浙江千里光藥材粉末0.2 g，共9份，精密稱定，按80%、100%、120%比例分別加入千里光菲靈堿對照品適量，再按照“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，按照“1.2.2”液質聯用條件進樣分析，測加樣回收率，計算RSD值。

1.2.4 千里光菲靈堿含量的測定。取11個產地的11批千里光藥材樣品各3份，每份0.2 g，精密稱定，分別按“1.2.1.2”方法制備供試品溶液，再按照“1.2.2”液質聯用條件進樣，測定峰面積并計算千里光菲靈堿含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 系統適應性試驗。試驗對千里光菲靈堿的離子對（m/z）334/120進行檢測，所得對照品、供試品和空白溶劑總離子流色譜圖如圖1所示，結果表明對照品和供試品溶液中千里光菲靈堿的保留時間均為7.1 min，空白溶劑在7.1 min時無出峰，證明該方法專屬性良好。且供試品所測定主峰旁邊無明顯雜峰，經計算樣品與其他組分峰的分離度>1.5，理論塔板數按千里光菲靈堿計算不低于4 000，符合藥典測定要求。試驗采用Q-Trap質譜對目標化合物進行二級碎片分析，EPI掃描選擇在正離子模式下，掃描范圍為m/z 50～400，得到的二級質譜圖如圖2所示。

2.1.2 標準曲線的繪制。按“1.2.3.2”方法操作，以質量濃度（ng/mL）為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，得出回歸方程為y=76 742x-13 277（R2=1），結果表明，千里

光菲靈堿在質量濃度0.5～1 000.0 ng/mL線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗。按“1.2.3.3”方法操作，連續進樣6次，測定千里光菲靈堿的峰面積，計算其RSD為2.19%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性試驗。按“1.2.3.4”方法操作，分別進樣平行樣6份，測定千里光菲靈堿的含量，計算其RSD為1.74%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 穩定性試驗。按“1.2.3.5”方法操作，測定千里光菲靈堿的含量，計算其RSD為2.85%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.1.6 加樣回收率試驗。由表2可見，在供試品中按80%、100%和120%比例分別加入千里光菲靈堿對照品時，平均回收率分別為96.90%、97.28%和102.13%，RSD值分別為1.42%、1.48%和1.16%，表明該方法準確、可靠，可用于千里光藥材中千里光菲靈堿的含量測定。

2.2 千里光菲靈堿的含量測定

由表3可知，不同產地的11批千里光藥材中千里光菲靈堿的含量差異較大，產自廣東、江蘇和云南的千里光藥材中千里光菲靈堿含量較低，而產自貴州、河南、四川、廣西和浙江的千里光藥材中千里光菲靈堿的含量較高。而產自浙江的千里光藥材中千里光菲靈堿含量明顯高于其他產地的，為0.811 1 μg/g。

3 討論與結論

現代藥理學研究表明，千里光具有廣譜抗菌、抗氧化、清除自由基、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用。千里光中亦含有有毒成分吡咯里西啶類生物堿，對人和家畜肝臟有蓄積性損害，可造成肝硬化和壞死[17]。世界衛生組織（WHO）在1989年發布了有關吡咯里西啶生物堿的健康與安全指南，推測導致成人肝臟肝竇阻塞綜合征（HSOS）的每日最低攝入量為每日1 mg PAs（按70 kg體重質量）。2020版《中國藥典》僅對千里光藥材中阿多尼弗林堿進行了含量限定，對其余吡咯里西啶類生物堿均無任何規定，其安全性值得注意。

該研究采用HPLC-MS/MS測定千里光中千里光菲靈堿的含量，采用MRM的掃描方式進行檢測，所建立的含量測定方法具有較好的穩定性、靈敏度、準確度，檢測結果科學、可靠。該試驗參考了Bolechová等[18]所建立的方法中有關離子對的選擇，在經歷多次調整之后最終所得到的HPLC-MS/MS的檢測條件，可為千里光藥材的相關研究提供參考。試驗中檢測了11個產地千里光藥材中千里光菲靈堿的含量，結果表明，產自廣東、江蘇和云南的千里光藥材中千里光菲靈堿含量較低，而產自貴州、河南、四川、廣西和浙江的千里光藥材中千里光菲靈堿的含量較高。由于不同地區千里光藥材中千里光菲靈堿的含量差異較大，為避免其造成的安全隱患，相關部門應給予充分的重視，從原藥材、成品制劑、用藥指導等方面進行嚴格把控，從整體水平揭示千里光等含PAs中藥及其制劑的用藥風險，為全面系統評價其安全性和指導其臨床合理用藥提供科學依據。

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