綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯對腹膜透析患者膜纖維化的防治作用及其機(jī)制研究

洪慧 張林

〔摘要〕 目的 探討綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate， EGCG）對腹膜透析（peritoneal dialysis， PD）患者腹膜纖維化的防治作用及其機(jī)制。方法 培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞（human peritoneal mesothelial cells， HPMCs），分別以0、12.5、25、50、100 μmol/L的EGCG對HPMCs進(jìn)行預(yù)處理后，采用晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products， AGEs）誘導(dǎo)建立上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）模型，將未做任何處理的細(xì)胞作為對照組。采用MTT法分析EGCG對HPMCs增殖的影響;劃痕實驗法分析EGCG對HPMCs遷移的影響;蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測HPMCs上皮細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白（Snail、E-cadherin、CK、ZO-1）和間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白（α-SMA、FSP1）表達(dá)水平;上皮跨膜細(xì)胞電阻儀檢測EGCG對HPMCs跨細(xì)胞電阻（transcellular resistance， TER）的影響。結(jié)果 與對照組比較，EMT模型組的細(xì)胞活力明顯增加， Snail、E-cadherin、CK和ZO-1蛋白表達(dá)水平降低，α-SMA和FSP1蛋白表達(dá)水平升高，TER值增加（P<0.05）;EGCG可以劑量依賴性地減少HPMCs細(xì)胞活力，抑制HPMCs細(xì)胞遷移，增加Snail、E-cadherin、CK和ZO-1蛋白表達(dá)水平，減少α-SMA和FSP1蛋白表達(dá)水平，降低TER值（P<0.05）。結(jié)論 EGCG可有效抑制HPMCs增殖和遷移，并通過上調(diào)上皮細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)，下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)，增加HPMCs通透性，抑制HPMCs的EMT，延緩腹膜纖維化，具有臨床應(yīng)用價值。

〔關(guān)鍵詞〕 表沒食子兒茶素沒食子酸酯;腹膜透析;人腹膜間皮細(xì)胞;上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化;終末期腎臟病

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.010

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect and mechanism of epigallocatechin gallate （EGCG） extracted from green tea on peritoneal fibrosis in peritoneal dialysis （PD） patients. Methods Human peritoneal mesothelial cells （HPMCs） were cultured and pretreated with 0， 12.5， 25， 50， 100 μmol/L EGCG respectively. The epithelial-mesenchymal transition （EMT） model was induced by advanced glycation end products （AGEs）. Cells without any treatment were taken as control group. MTT method was used to analyze the effect of EGCG on HPMCs proliferation， scratch test was used to analyze the effect of EGCG on HPMCs migration， Western blot method was used to detect the expression level of HPMCs epithelial molecular marker protein （Snail， E-cadherin， CK， ZO-1） and interstitial molecular marker protein （α-SMA， FSP1）， and epithelial transmembrane cell resistance meter was used to detect the effect of EGCG on HPMCs transcellular resistance （TER）. Results Compared with the control group， the cell viability of EMT model group was significantly increased， the protein expression levels of Snail， E-cadherin， CK and ZO-1 were decreased， the protein expression levels of α-SMA and FSP1 were increased， and the TER value was increased （P<0.05）. EGCG can dose-dependently reduce the viability of HPMCs cells， inhibit the migration of HPMCs cells， increase the protein expression levels of Snail， E-cadherin， CK and ZO-1， decrease the protein expression levels of α-SMA and FSP1， and decrease the TER value （P<0.05）. Conclusion EGCG can effectively inhibit the proliferation and migration of HPMCs， increase the permeability of HPMCs， inhibit the EMT of HPMCs， and delay the peritoneal fibrosis by up-regulating the expression of epithelial cell molecular marker protein， down-regulating the expression of interstitial cell molecular marker protein， which has clinical application value.

〔Keywords〕 epigallocatechin gallate; peritoneal dialysis; human peritoneal mesothelial cells; epithelial-mesenchymal transition; end-stage renal disease

腹膜透析（peritoneal dialysis， PD）是終末期腎臟病（end-stage renal disease， ESRD）患者常用的腎臟替代療法，占所有形式腎臟替代治療的10%以上[1]。臨床證實，PD可通過清除ESRD患者體內(nèi)代謝產(chǎn)物、毒性物質(zhì)及糾正水、電解質(zhì)平衡紊亂，改善其生活質(zhì)量[2]。腹膜為腹部臟器提供支持，腹腔臟器的血液、淋巴和神經(jīng)組織經(jīng)由腹膜與外界相連。研究顯示，PD治療期間，由于持續(xù)暴露于高滲、高糖和酸性透析溶液中，可造成腹膜急或慢性炎癥及損傷，增加腹膜纖維化、血管生成和血管病變的風(fēng)險，最終導(dǎo)致PD治療失敗[3]。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，人腹膜間皮細(xì)胞（human peritoneal mesothelial cells， HPMCs）的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）為腹膜纖維化的細(xì)胞學(xué)改變。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate， EGCG）為綠茶多酚中的主要單體和活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動脈硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎和抗腫瘤的作用[5]。近來研究[6]顯示，EGCG可抑制多肽纖維化，且在中性和弱堿性條件下可轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的氧化產(chǎn)物，產(chǎn)生比EGCG更強(qiáng)的抗蛋白質(zhì)纖維化作用。目前，國內(nèi)外對EGCG在PD過程中EMT作用及機(jī)制報道尚少。因此，本研究探討EGCG對PD患者腹膜纖維化的防治作用及機(jī)制，旨在為臨床提供理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 ?實驗材料

1.1.1 ?主要試劑 ?HPMCs（批號：LM-hy926-112，上海聯(lián)邁生物科技有限公司）;EGCG（批號：JZ-sh540-113，上海吉至生化科技有限公司）;DMEM高糖完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清）（批號：PM150210B，武漢普諾賽生命科技有限公司）;胰蛋白酶溶液（2.5%）（批號：CC0134，北京雷根生物技術(shù)有限公司）;晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products， AGEs）（批號：EY-D1072，上海一研生物科技有限公司）;MTT溶液（批號：M1020）、DMSO溶液（批號：D8371）、細(xì)胞裂解液（批號：R0010）、麗春紅S染液（批號：P8330）、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒（批號：M1020）均購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012，上海碧云天生物科技有限公司）。

1.1.2 ?主要儀器 ?凝膠圖像處理系統(tǒng)（型號：Tanon-1600，上海天能科技有限公司）;Millicell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿（型號：PIEP12R48，北京明陽科華生物科技有限公司）;酶標(biāo)儀（型號：680，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）;上皮跨膜細(xì)胞電阻儀（型號：MERS00002，北京明陽科華生物科技有限公司）。

1.2 ?細(xì)胞培養(yǎng)

取HPMCs置于DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng);顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，融合度達(dá)80%時，棄去培養(yǎng)液，PBS溶液沖洗;滴加胰蛋白酶溶液，顯微鏡下觀察細(xì)胞明顯收縮和肉眼觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化時，吸除培養(yǎng)液終止消化;加入新的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)基。

1.3 ?EMT模型構(gòu)建及分組

EMT模型構(gòu)建按照張林等[7]創(chuàng)建的實驗方法進(jìn)行，即HPMCs細(xì)胞加入500 μg/mL的AGEs處理72 h。實驗分組如下：對照組（未做任何處理）;EMT模型組（500 μg/mL的AGEs處理72 h）;EGCG 12.5、25、50、100 μmol/L組（12.5、25、50、100 μmol/L EGCG預(yù)處理1 h+500 μg/mL的AGEs處理72 h）。

1.4 ?MTT法檢測細(xì)胞增殖

取生長狀態(tài)良好的HPMCs，滴加胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞;加入PBS溶液重懸細(xì)胞，取96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，濃度為5×103個/孔，分別標(biāo)記0、24、48 h，每組設(shè)置3個復(fù)孔，5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于24、48 h取出板，每孔滴加10 μL的MTT溶液，5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h;移液器吸去孔內(nèi)液體，加入150 μL的DMSO溶液，置于搖床上低速震蕩10 min;利用酶標(biāo)儀測定波長為490 nm的吸光度值（absorbance， A）。

1.5 ?劃痕實驗法檢測細(xì)胞遷移

取6孔板，用直尺和馬克筆在其背后劃均勻橫線，每條間隔0.5～1 cm，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線;取生長狀態(tài)良好的HPMCs，滴加胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞;加入PBS溶液重懸細(xì)胞，取6孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，濃度為5×104個/孔，分別標(biāo)記0、24、48 h，每組設(shè)置3個復(fù)孔，5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱中過夜;第2天用Tip頭和直尺垂直于孔底部橫線劃痕，每組設(shè)置3個平行孔;PBS溶液沖洗3次，每次5 min，去除劃下細(xì)胞后，加入新的培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于0、24、48 h取樣拍照，每孔細(xì)胞缺失帶均隨機(jī)選擇4個不同位置進(jìn)行拍照取平均值。

1.6 ?蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測上皮分子標(biāo)志蛋白和間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)

取生長狀態(tài)良好的HPMCs，加入200 μL細(xì)胞裂解液，30 min后置于離心儀上4 ℃，12 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm）;取上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，利用酶標(biāo)儀測定樣品總蛋白濃度;取蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳試驗，電泳完成后將膜以麗春紅S染液染色5 min;自來水沖洗后將膜晾干備用;TBST溶液從下向上浸濕膜，移至含封閉液的培養(yǎng)皿中，室溫脫色搖床上封閉1 h;加入TBST溶液稀釋后的Snail（1∶1000）、E-cadherin（1∶1000）、CK（1∶1000）、ZO-1（1∶1000）、α-SMA（1∶1000）和FSP1（1∶1000），以β-actin（1∶1000）為內(nèi)參蛋白;取出膜，濾紙吸去殘留液后，膜蛋白面朝下置于抗體液面上，室溫孵育1 h;室溫下置于脫色搖床上以TBST溶液清洗2次，每次10 min;相同步驟準(zhǔn)備二抗稀釋液，并與膜接觸，室溫下置于脫色搖床上反應(yīng)1 h;TBST溶液清洗3次，每次5 min;按照ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒說明書操作，利用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和光密度（optical density， OD）值。

1.7 ?上皮跨膜細(xì)胞電阻儀檢測跨細(xì)胞電阻（transcellular resistance， TER）值

取雙池培養(yǎng)板，內(nèi)池為Millicell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，外池為12孔板，內(nèi)外池均加入完全培養(yǎng)基，37 ℃過夜;取生長狀態(tài)良好的HPMCs，滴加胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞;加入PBS溶液重懸細(xì)胞;調(diào)試電阻儀，以通電后電阻值為基礎(chǔ)電阻值;棄去內(nèi)外池培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液，內(nèi)池中以5×104個/cm2密度接種HPMCs細(xì)胞懸液，5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng);每組設(shè)立3個平行孔，分別于0、24 h測定電阻值。單層HPMCs TER值=（HPMCs細(xì)胞電阻值-基礎(chǔ)電阻值）/Millicell底面積。

1.8 ?統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用“x±s”表示，所有數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Snk-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?EGCG對HPMCs增殖的影響

與對照組比較，EMT模型組的細(xì)胞活力在24、48 h明顯增加（P<0.05），而給予EGCG（12.5、25、50、100 μmol/L）干預(yù)，可以劑量依賴性地減少細(xì)胞活力，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 ?EGCG對HPMCs遷移的影響

與對照組比較，EMT模型組細(xì)胞遷移數(shù)明顯增加（P<0.05），而給予EGCG（12.5、25、50、100 μmol/L）干預(yù)，可以劑量依賴性地減少細(xì)胞遷移，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.3 ?EGCG對HPMCs上皮細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，EMT模型組Snail、E-cadherin、CK和ZO-1蛋白表達(dá)水平降低（P<0.01，P<0.001）;而給予EGCG（12.5、25、50、100 μmol/L）干預(yù)后，Snail、E-cadherin、CK和ZO-1的蛋白表達(dá)增加（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。見圖2。

2.4 ?EGCG對HPMCs間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，EMT模型組α-SMA和FSP1蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），而給予EGCG（12.5、25、50、100 μmol/L）干預(yù)后，α-SMA和FSP1的蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）。見圖3。

2.5 ?EGCG對HPMCs TER的影響

與對照組比較，EMT模型組TER值增高（P<0.05）;給予EGCG（12.5、25、50、100 μmol/L）干預(yù)后，隨著EGCG處理濃度增加，TER值逐漸降低，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

ESRD為各種原因引起的腎臟病變的終末期，又稱尿毒癥。隨著高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等疾病發(fā)病率的升高，以及老年人口比例的增加，ESRD發(fā)病率也明顯升高[8]。ESRD階段，患者除有水、電解質(zhì)代謝紊亂和酸堿平衡失調(diào)外，還可因大量代謝終末產(chǎn)物和毒性物質(zhì)潴留體內(nèi)引起一系列尿毒癥癥狀，嚴(yán)重影響患者身心健康[9]。腎移植雖為ESRD最有效的治療方法，但因供體缺乏，透析治療成為ESRD患者常用的腎臟替代療法。PD是將腹膜透析液經(jīng)腹膜透析管灌入腹腔，以排出體內(nèi)毒素和多余水分的技術(shù)。已有研究[10]證實，PD可有效保護(hù)ESRD患者殘余腎功能，達(dá)到較滿意的臨床效果，且安全性較高。超濾衰竭是因腹膜本身失去超濾功能而出現(xiàn)的并發(fā)癥，為維持性PD患者嚴(yán)重并發(fā)癥之一，不僅是PD患者退出治療的主要原因，還是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[11]。有文獻(xiàn)[12]報道，隨著PD時間的延長，PD患者透析1年超濾衰竭發(fā)生率<3.5%，3年為9.5%，4年以上可達(dá)36.2%。目前認(rèn)為，腹膜纖維化是超濾衰竭發(fā)生的重要原因之一[13]。

EGCG是從綠茶葉中分離得到的兒茶素類單體化合物，為綠茶主要的活性和水溶性成分，具有抗氧化、抗癌、抗突變等活性。HPMCs是腹膜的重要組成部分，在PD及腹膜纖維化中扮演著極其重要的角色[14]。本研究結(jié)果顯示，EGCG對HPMCs增殖和遷移均顯示出抑制作用（P<0.05），提示EGCG可通過抑制HPMCs增殖和遷移，修復(fù)AGEs所致的HPMCs損傷，延緩腹膜纖維化進(jìn)程。EMT是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，PD過程中EMT的出現(xiàn)與腹膜纖維化進(jìn)展密切相關(guān)。Kanlaya R等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可通過Nrf2途徑對草酸誘導(dǎo)的腎小管EMT起保護(hù)作用。Li T T等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可通過阻斷TGF-β1/Smad信號通路抑制甲狀腺癌細(xì)胞的EMT和侵襲。EMT過程多伴有上皮細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)的降低和間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)的升高[18-19]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，EGCG各濃度組Snail、E-cadherin、CK和ZO-1蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），α-SMA和FSP1蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），符合以往研究結(jié)果。同時本研究發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG處理濃度增加，Snail、E-cadherin、CK和ZO-1蛋白表達(dá)水平逐漸升高（P<0.05），α-SMA和FSP1蛋白表達(dá)水平逐漸降低（P<0.05），提示EGCG可通過上調(diào)上皮細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)，下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)，抑制HPMCs的EMT。TER是評估內(nèi)皮細(xì)胞通透性的指標(biāo)[20]。有研究[20]表明，腹膜纖維化可導(dǎo)致腹膜通透性降低，增加基質(zhì)蓄積，降低PD效能。本研究利用上皮跨膜細(xì)胞電阻儀檢測EGCG對HPMCs跨內(nèi)皮電阻的影響發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，EGCG各濃度組TER值降低（P<0.05），符合以往研究結(jié)果，且隨著EGCG處理濃度增加，TER值逐漸降低（P<0.05），提示EGCG可有效增加HPMC通透性，提高透析效能，延緩腹膜纖維化。

綜上所述，EGCG可有效抑制HPMCs增殖和遷移，并通過上調(diào)上皮細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)，下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志蛋白表達(dá)，增加HPMC通透性，抑制HPMCs的EMT，延緩腹膜纖維化，具有臨床應(yīng)用價值。

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